The generation of induced pluripotent stem (iPS) cells has enabled the derivation of patient-specific pluripotent cells and provided valuable experimental platforms to model human disease. Patient-specific iPS cells are also thought to hold great therapeutic potential, although direct evidence for this is still lacking. Here we show that, on correction of the genetic defect, somatic cells from Fanconi anaemia patients can be reprogrammed to pluripotency to generate patient-specific iPS cells. These cell lines appear indistinguishable from human embryonic stem cells and iPS cells from healthy individuals. Most importantly, we show that corrected Fanconi-anaemia-specific iPS cells can give rise to haematopoietic progenitors of the myeloid and erythroid lineages that are phenotypically normal, that is, disease-free. These data offer proof-of-concept that iPS cell technology can be used for the generation of disease-corrected, patient-specific cells with potential value for cell therapy applications. The feasibility of deriving patient-specific iPS cells and their value as experimental models for specific diseases were reported almost a year ago. Patient-specific iPS cells are also thought to have great therapeutic potential, though direct evidence was lacking. Raya et al. now show that iPS cells from Fanconi anaemia patients can, after correction of the genetic defect, be reprogrammed to generate patient-specific iPS cells that can give rise to disease-free haematopoietic progenitors of myeloid and erythroid lineages. These cells have potential value for cell therapy. The generation of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPS cells) is thought to hold great therapeutic potential. Here, somatic cells from Fanconi anaemia patients are reprogrammed to pluripotency after correction of the genetic defect, generating patient-specific iPS cells.

Previous studies have shown the relevance of bone marrow‐derived MSCs (BM‐MSCs) in controlling graft‐versus‐host disease (GVHD) after allogeneic transplantation. Since adipose tissue‐derived MSCs (Ad‐MSCs) may constitute a good alternative to BM‐MSCs, we have expanded MSCs derived from human adipose tissue (hAd‐MSCs) and mouse adipose tissue (mAd‐MSCs), investigated the immunoregulatory properties of these cells, and evaluated their capacity to control GVHD in mice. The phenotype and immunoregulatory properties of expanded hAd‐MSCs were similar to those of human BM‐MSCs. Moreover, hAd‐MSCs inhibited the proliferation and cytokine secretion of human primary T cells in response to mitogens and allogeneic T cells. Similarly, ex vivo expanded mAd‐MSCs had an equivalent immunophenotype and exerted immunoregulatory properties similar to those of hAd‐MSCs. Moreover, the infusion of mAd‐MSCs in mice transplanted with haploidentical hematopoietic grafts controlled the lethal GVHD that occurred in control recipient mice. These findings constitute the first experimental proof that Ad‐MSCs can efficiently control the GVHD associated with allogeneic hematopoietic transplantation, opening new perspectives for the clinical use of Ad‐MSCs.

Gene transfer vectors may cause clonal imbalance and even malignant cell transformation by insertional upregulation of proto-oncogenes. Lentiviral vectors (LV) with their preferred integration in transcribed genes are considered less genotoxic than gammaretroviral vectors (GV) with their preference for integration next to transcriptional start sites and regulatory gene regions. Using a sensitive cell culture assay and a series of self-inactivating (SIN) vectors, we found that the lentiviral insertion pattern was approximately threefold less likely than the gammaretroviral to trigger transformation of primary hematopoietic cells. However, lentivirally induced mutants also showed robust replating, in line with the selection for common insertion sites (CIS) in the first intron of the Evi1 proto-oncogene. This potent proto-oncogene thus represents a CIS for both GV and LV, despite major differences in their integration mechanisms. Altering the vectors' enhancer–promoter elements had a greater effect on safety than the retroviral insertion pattern. Clinical grade LV expressing the Wiskott–Aldrich syndrome (WAS) protein under control of its own promoter had no transforming potential. Mechanistic studies support the conclusion that enhancer-mediated gene activation is the major cause for insertional transformation of hematopoietic cells, opening rational strategies for risk prevention.

Abstract Fanconi anemia (FA) is a DNA repair disorder resulting from mutations in genes encoding for FA DNA repair complex components and is characterized by variable congenital abnormalities, bone marrow failure (BMF), and high incidences of malignancies. FA mosaicism arises from reversion or other compensatory mutations in hematopoietic cells and may be associated with BMF reversal and decreased blood cell sensitivity to DNA-damaging agents (clastogens); this sensitivity is a phenotypic and diagnostic hallmark of FA. Uncertainty regarding the clinical significance of FA mosaicism persists; in some cases, patients have survived multiple decades without BMF or hematologic malignancy, and in others hematologic failure occurred despite the presence of clastogen-resistant cell populations. Assessment of mosaicism is further complicated because clinical evaluation is frequently based on clastogen resistance in lymphocytes, which may arise from reversion events both in lymphoid-specific lineages and in more pluripotent hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). In this review, we describe diagnostic methods and outcomes in published mosaicism series, including the substantial intervals (1–6 years) over which blood counts normalized, and the relatively favorable clinical course in cases where clastogen resistance was demonstrated in bone marrow progenitors. We also analyzed published FA mosaic cases with emphasis on long-term clinical outcomes when blood count normalization was identified. Blood count normalization in FA mosaicism likely arises from reversion events in long-term primitive HSPCs and is associated with low incidences of BMF or hematologic malignancy. These observations have ramifications for current investigational therapeutic programs in FA intended to enable gene correction in long-term repopulating HSPCs.

Fanconi Anemia (FA) is a debilitating genetic disorder with a wide range of severe symptoms including bone marrow failure and predisposition to cancer. CRISPR-Cas genome editing manipulates genotypes by harnessing DNA repair and has been proposed as a potential cure for FA. But FA is caused deficiencies in DNA repair itself, preventing the use of editing strategies such as homology directed repair. Recently developed base editing (BE) systems do not rely on double stranded DNA breaks and might be used to target mutations in FA genes, but this remains to be tested. Here we develop a proof of concept therapeutic base editing strategy to address two of the most prevalent FANCA mutations in patient cells. We find that optimizing adenine base editor construct, vector type, guide RNA format, and delivery conditions lead to very effective genetic modification in multiple FA patient backgrounds. Optimized base editing restored FANCA expression, molecular function of the FA pathway, and phenotypic resistance to crosslinking agents. ABE8e mediated editing in primary hematopoietic stem and progenitor cells from an FA patient was both genotypically effective and restored FA pathway function, indicating the potential of base editing strategies for future clinical application in FA.

Development of advanced gene and cell therapies for the treatment of genetic diseases requires confident animal and cellular models to test their efficacy and is crucial in the cases where no primary samples from patients are available. CRISPR/Cas9 technology, has become one of the most spread endonuclease tools for editing the genome at will. Moreover, it is known that the use of two guides tends to produce the precise deletion between the guides via NHEJ. Different distances between guides were tested (from 8 to 500 base pairs). We found that distances between the two cutting sites and orientation of Cas9 protein-DNA interaction are important for the efficiency within the optimal range (30-60 bp), we could obtain new genetically reproducible models for two rare disease, a Pyruvate Kinase Deficiency model, using human primary cells, and a (for in vivo primary hyperoxaluria therapeutic mouse model. We demonstrate that the use of a 2-guideRNAs at the optimal distance and orientation is a powerful strategy for disease modelling in those diseases where the availability of primary cells is limited.