Abstract Rho-family GTPase Rac1 activates the WAVE regulatory complex (WRC) to drive Arp2/3-mediated actin polymerization in many essential processes. Rac1 binds to WRC at two distinct sites—the A and D sites. Precisely how Rac1 binds and how the binding triggers WRC activation remain unknown. Here we report WRC structures by itself, and when bound to single or double Rac1 molecules, at ∼3 Å resolutions by cryogenic-electron microscopy. The structures reveal that Rac1 binds to the two sites by distinct mechanisms, and binding to the A site, but not the D site, drives WRC activation. Activation involves a series of unique conformational changes leading to the release of sequestered WCA (WH2- central-acidic) polypeptide, which stimulates the Arp2/3 complex to polymerize actin. Together with biochemical and cellular analyses, the structures provide a novel mechanistic understanding of how the Rac1-WRC-Arp2/3-actin signaling axis is regulated in diverse biological processes and diseases.

Immunodeficiency often coincides with immune hyperresponsiveness such as autoimmunity, lymphoproliferation, or atopy, but the molecular basis of this paradox is typically unknown. We describe four families with immunodeficiency coupled with atopy, lymphoproliferation, cytokine overproduction, hemophagocytic lymphohistocytosis, and autoimmunity. We discovered loss-of-function variants in the gene NCKAP1L, encoding the hematopoietic-specific Hem1 protein. Three mutations cause Hem1 protein and WAVE regulatory complex (WRC) loss, thereby disrupting actin polymerization, synapse formation, and immune cell migration. Another mutant, M371V encodes a stable Hem1 protein but abrogates binding of the Arf1 GTPase and identifies Arf1 as a critical Hem1 regulator. All mutations reduce the cortical actin barrier to cytokine release explaining immune hyperresponsiveness. Finally, Hem1 loss blocked mTORC2-dependent AKT phosphorylation, T cell proliferation, and effector cytokine production during T cell activation. Thus, our data show that Hem1 independently governs two key regulatory complexes, the WRC and mTORC2, and how Hem1 loss causes a combined immunodeficiency and immune hyperresponsiveness disease.

Summary Crosstalk between Rho- and Arf-family GTPases plays an important role in linking actin cytoskeletal remodeling to membrane protrusion, organelle structure, and vesicle trafficking. The central actin regulator, WAVE Regulatory Complex (WRC), is a converging point of Rac1 (a Rho-family GTPase) and Arf signaling in many processes, but how Arf promotes WRC activation is unknown. Here we reconstituted a direct interaction between Arf and WRC. This interaction can be greatly enhanced by Rac1 binding to the D site of the WRC. Arf1 binds to a newly identified conserved surface on Sra1 located between the D site and the WH2 helix of WAVE1, which can drive WRC activation using a mechanism distinct from that of Rac1. Mutating Arf binding site abolishes Arf1-WRC interaction, disrupts Arf1-mediated WRC activation, and impairs lamellipodia morphology. This work uncovers a new mechanism underlying WRC activation and provides a mechanistic foundation for studying how WRC-mediated actin polymerization links Arf and Rac signaling in the cell.