Pollen tube cells elongate based on actin- dependent targeted secretion at the tip. Rho family small GTPases have been implicated in the regulation of related processes in animal and yeast cells. We have functionally characterized Rac type Rho family proteins that are expressed in growing pollen tubes. Expression of dominant negative Rac inhibited pollen tube elongation, whereas expression of constitutive active Rac induced depolarized growth. Pollen tube Rac was found to accumulate at the tip plasma membrane and to physically associate with a phosphatidylinositol monophosphate kinase (PtdIns P-K) activity. Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PtdIns 4, 5-P2), the product of PtdIns P-Ks, showed a similar intracellular localization as Rac. Expression of the pleckstrin homology (PH)-domain of phospholipase C (PLC)-δ1, which binds specifically to PtdIns 4, 5-P2, inhibited pollen tube elongation. These results indicate that Rac and PtdIns 4, 5-P2 act in a common pathway to control polar pollen tube growth and provide direct evidence for a function of PtdIns 4, 5-P2 compartmentalization in the regulation of this process.

Pathogenic Escherichia coli are responsible for a variety of diseases, including diarrhoea, haemolytic uraemic syndrome, kidney infection, septicaemia, pneumonia and meningitis. Toxins called cytotoxic necrotizing factors (CNFs) are among the virulence factors produced by uropathogenic (CNF1) or enteropathogenic (CNF2) E. coli strains that cause diseases in humans and animals, respectively. CNFs induce an increase in the content of actin stress fibres and focal contacts in cultured cells. Effects of CNFs on the actin cytoskeleton correlated with a decrease in the electrophoretic mobility of the GTP-binding protein Rho and indirect evidence indicates that CNF1 might constitutively activate Rho. Here we show that CNF1 catalyses the deamidation of a glutamine residue at position 63 of Rho, turning it into glutamic acid, which inhibits both intrinsic GTP hydrolysis and that stimulated by its GTPase-activating protein (GAP). Thus, this deamidation of glutamine 63 by CNF1 leads to the constitutive activation of Rho, and induces the reorganization of actin stress fibres. To our knowledge, CNF1 is the first example of a bacterial toxin acting by deamidation of a specific target protein.

The rho family of GTP-binding proteins regulates actin filament organization. In unpolarized mammalian cells, rho proteins regulate the assembly of actin-containing stress fibers at the cell-matrix interface. Polarized epithelial cells, in contrast, are tall and cylindrical with well developed intercellular tight junctions that permit them to behave as biologic barriers. We report that rho regulates filamentous actin organization preferentially in the apical pole of polarized intestinal epithelial cells and, in so doing, influences the organization and permeability of the associated apical tight junctions. Thus, barrier function, which is an essential characteristic of columnar epithelia, is regulated by rho.

Abstract BAR domain proteins contribute to membrane deformation in diverse cellular processes. The inverted-BAR (I-BAR) protein IRSp53, for instance, is found on the inner leaflet of the tubular membrane of filopodia; however its role in the formation of these structures is incompletely understood. Here we develop an original assay in which proteins are encapsulated in giant unilamellar vesicles connected to membrane nanotubes. Our results demonstrate that I-BAR dimers sense negative membrane curvature. Experiment and theory reveal that the I-BAR displays a non-monotonic sorting with curvature, and expands the tube at high imposed tension while constricting it at low tension. Strikingly, at low protein density and tension, protein-rich domains appear along the tube. This peculiar behaviour is due to the shallow intrinsic curvature of I-BAR dimers. It allows constriction of weakly curved membranes coupled to local protein enrichment at biologically relevant conditions. This might explain how IRSp53 contributes in vivo to the initiation of filopodia.

Summary Recently, an intestinal dysbiotic microbiota with enrichment in oral cavity bacteria has been described in colorectal cancer (CRC) patients. Here we characterized and investigated one of these oral pathobionts, the Gram-positive anaerobic coccus Parvimonas micra. We identified two phylotypes (A and B) exhibiting different phenotypes and adhesion capabilities. We observed a strong association of phylotype A with CRC, with its higher abundance in feces and in tumoral tissue compared with the normal homologous colonic mucosa, which was associated with a distinct methylation status of patients. By developing an in vitro hypoxic co-culture system of human primary colonic cells with anaerobic bacteria, we showed that P. micra phylotype A alters the DNA methylation profile promoters of key tumor-suppressor genes, oncogenes, and genes involved in epithelial-mesenchymal transition. In colonic mucosa of CRC patients carrying P. micra phylotype A, we found similar DNA methylations alterations, together with significant enrichment of differentially expressed genes in pathways involved in inflammation, cell adhesion, and regulation of actin cytoskeleton, providing evidence of P. micra possible role in the carcinogenic process.

Abstract Although the botulinum neurotoxins (BoNTs) are among the most toxic compounds found in nature, their molecular mechanism of action is far from being elucidated. A key event is the conformational transition due to the acidification of the interior of synaptic vesicles, and leading to the translocation of the BoNT catalytic domain into the neuronal cytosol. To investigate these conformational variations, homology modelling and atomistic simulations are combined to explore the internal dynamics of the subtypes BoNT/A1, the most-used in medical applications, and BoNT/E1, the most kinetically efficient. This first simulation study of di-chain BoNTs in closed and open states includes the effects of neutral and acidic pH. The conformational mobility is driven by domains displacements; the ganglioside binding site in the receptor binding domain, the translocation domain (HC NT ) switch and the belt α helix visit multiple conformations depending on the primary sequence and on the pH. Fluctuations of the belt α helix are observed for closed conformations of the toxins and at acidic pH, and patches of more accessible residues appear in the same conditions in the core translocation domain HC NT . These findings suggest that during translocation, the larger mobility of belt could be transmitted to HC NT , leading to a favorable interaction of HC NT residues with the non-polar membrane environment. Key Contribution The molecular dynamics simulations presented here provide a structural and functional annotation of full-length BoNTs composed by two distinct protein chains. Two different conformations (open and closed) as well as two different protonation states, corresponding to acidic and neutral pH, have been considered. Results from the present work supports a model of mobility in which the individual domains fluctuate around stable conformations and the overall structure mobility arise from relative displacements of the domains.

SUMMARY Epidemiological projections point to acquisition of ever-expanding multidrug resistance (MDR) by Escherichia coli , a commensal of the digestive tract acting as a source of urinary tract pathogens. We performed a high-throughput genetic screening of predominantly clinical E. coli isolates from wide geographical origins. This revealed a preferential distribution of the Cytotoxic Necrotizing Factor 1 (CNF1)-toxin encoding gene, cnf1 , in four sequence types encompassing the pandemic E. coli MDR lineage ST131. This lineage is responsible for a majority of extraintestinal infections that escape first-line antibiotic treatment and has known enhanced capacities to colonize the gastrointestinal tract (GIT). Statistical modeling uncovered a dominant global expansion of cnf1- positive strains within multidrug-resistant ST131 subclade H 30Rx/C2. Despite the absence of phylogeographical signals, cnf1 -positive isolates adopted a clonal distribution into clusters on the ST131- H 30Rx/C2 phylogeny, sharing a similar profile of virulence factors and the same cnf1 allele. Functional analysis of the cnf1 -positive clinical strain EC131GY ST131- H 30Rx/C2, established that a cnf1 -deleted EC131GY is outcompeted by the wildtype strain in a mouse model of competitive infection of the bladder while both strains behave similarly during monoinfections. This points for positive selection of cnf1 during UTI rather than urovirulence. Wildtype EC131GY also outcompeted the mutant when concurrently inoculated into the gastrointestinal tract, arguing for selection within the gut. Whatever the site of selection, these findings support that the benefit of cnf1 enhancing host colonization by ST131- H 30Rx/C2 in turn drives a worldwide dissemination of the cnf1 gene together with extended spectrum of antibiotic resistance genes.

ABSTRACT Intratumoral bacteria locally contribute to cellular and molecular tumor heterogeneity that support cancer stemness through poorly understood mechanisms. This study aims to explore how Colibactin-producing Escherichia coli (CoPEC) flexibly alters the tumor microenvironment in right-sided colorectal cancer (CRC). Metabolomic and transcriptomic spatial profiling uncovered that CoPEC colonization establishes a high-glycerophospholipid microenvironment within the tumor that is conducive to exhaustion of infiltrated CD8 + T cell and has a lowered prognostic value in right-sided CRC. Mechanistically, the accumulation of lipid droplets in infected cancer cells relied on the production of colibactin as a measure to limit genotoxic stress and supply with sufficient energy for sustaining cell survival and lowering tumor immunogenicity. Specifically, a heightened phosphatidylcholine remodeling of CoPEC-infected cancer cells by the enzyme of the Land’s cycle coincided with a lowered accumulation of proapoptotic ceramide and lysophosphatidylcholine. Consequently, a reduced infiltration of CD8 + T lymphocytes that produce the cytotoxic cytokines IFN-γ was found where invading bacteria have been geolocated. By contrast, such an immunosuppressive dysmetabolic process was not observed when human colon cancer cells were infected with the mutant strain that did not produce colibactin (11G5δClbQ). This work revealed an unexpected property of CoPEC on lipid overload within tumors that could locally provide an inflammatory environment leading to immunosuppressive mechanisms and tumor expansion. This may pave the way for improving chemoresistance and subsequently outcome of CRC patients who are colonized by CoPEC.

ABSTRACT A challenge for the development of host-targeted anti-infectives against a large spectrum of AB-like toxin-producing bacteria encompasses the identification of chemical compounds corrupting toxin transport through both endolysosomal and retrograde pathways. Here, we performed a high-throughput screening of small chemical compounds blocking active Rac1 proteasomal degradation triggered by the Cytotoxic Necrotizing Factor-1 (CNF1) toxin, followed by orthogonal screens against two AB toxins hijacking defined endolysosomal (Diphtheria toxin) or retrograde (Shiga-like toxin 1) pathways to intoxicate cells. This led to the identification of the molecule N-(3,3-diphenylpropyl)-1-propyl-4-piperidinamine, referred to as C910. This compound induces the swelling of EEA1-positive early endosomes, in absence of PIKfyve kinase inhibition, and disturbs the trafficking of CNF1 and the B-subunit of Shiga toxin along the endolysosomal or retrograde pathways, respectively. Together, we show that C910 protects cells against 8 bacterial AB toxins including large clostridial glucosylating toxins from Clostridium difficile . Of interest, C910 also reduced viral infection in vitro including influenza A virus subtype H1N1 and SARS-CoV-2. Moreover, parenteral administration of C910 to the mice resulted in its accumulation in lung tissues and reduced lethal influenza infection.

SUMMARY Extracellular matrix (ECM) elasticity is perceived by cells via focal adhesion structures, which transduce mechanical cues into chemical signalling to conform cell behaviour. Although the contribution of ECM compliance to the control of cell migration or division has been extensively studied, little has been reported regarding infectious processes. We have studied how mechanical properties of the ECM impact invasion of cells by the extraintestinal Escherichia coli pathogen UTI89. We show that UTI89 takes advantage, via its CNF1 toxin, of integrin mechanoactivation to trigger its invasion into cells. We identified OPTN as a protein regulated by ECM stiffness whose function is required for bacterial invasion and integrin mechanical coupling and for stimulation of HACE1 E3 ligase activity towards the Rac1 GTPase. We showed that OPTN knockdown cells display enhanced Rac1 activation, strong mechanochemical adhesion signalling and increased cyclin D1 translation, together with enhanced cell proliferation independent of ECM stiffness. Despite such features, OPTN knockdown cells displayed defective traction force buildup associated with limited cellular invasion by UTI89. Together, our data indicate that OPTN, through a new role in mechanobiology, supports CNF1-producing uropathogenic E. coli invasion and links HACE1-mediated ubiquitylation of Rac1 to ECM mechanical properties and integrin mechanotransduction.