Abstract The trimeric betaine symporter BetP senses an osmotic upshift via its osmosensory C-terminal domain and responds rapidly with a steep increase in transport rate. Full activation requires both an elevated internal K + concentration and a yet unknown membrane stimulus. Moreover, the molecular mechanisms of stress sensing and upregulation remain unclear. Here, we show that K + binding to BetP in vivo is highly cooperative. Using X-ray crystallography, we identify four putative K + interaction sites at the C-terminal domains of BetP. Single particle CryoEM on BetP reconstituted in amphipols (AMP-BetP), in the absence of K + , revealed that the three C-terminal domains are oriented symmetrically near the membrane surface, representing a new downregulated state. The presence of K + resulted in asymmetric partial unfolding of the C-terminal domains, which was assigned as an intermediate between the downregulated state and the conformation observed in crystal structures. Attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy in 2D crystals of BetP reveal glutamate/aspartate and tyrosine responses to K + , in agreement with the identified K + interaction sites, as well as specific unfolding events in the C-terminal domain upon activation. A rearrangement of the relative protomer orientations confers upregulation through key structural elements involved in the alternating access of BetP affecting sodium and betaine binding affinities. Although K + -specific regulation is unique to BetP we discuss unfolding/refolding of sensory domains as a unifying element in hyperosmotic stress response of osmoregulated transporters.

Corynebacterium glutamicum co-metabolizes most carbon sources, such as glucose and sucrose. Uptake of those sugars by the PTS involves a glucose- and a sucrose-specific permease EIIGlc ( ptsG ) and EIISuc ( ptsS ), respectively. Block of glycolysis by deletion of pgi (encodes phosphoglucoisomerase) redirects glucose-driven carbon flux towards pentose phosphate pathway. C. glutamicum Δ pgi grows poorly with glucose but has unaffected, good growth with sucrose. However, addition of glucose to sucrose-cultivated C. glutamicum Δ pgi immediately arrested growth via inhibition of the EIISuc-mediated sucrose uptake and reduction of ptsS -mRNA amounts. Kinetic analyses revealed that sucrose uptake inhibition in C. glutamicum Δ pgi took place within 15 s after glucose addition. We show that inhibition of PTS-mediated sucrose uptake occurs as direct response to glucose-6-P accumulation. Moreover, addition of non-PTS substrates, which are metabolized to glucose-6-P such as maltose or glucose-6-P itself (uptake was enabled by heterologously produced UhpT), led to similar growth and sucrose uptake inhibition as glucose addition. Despite EIIGlc not being involved in uptake of these substrates, negative effects on sucrose uptake after addition of maltose and glucose-6-P were absent in the EIIGlc-deficient strain C. glutamicum Δ pgi Δ ptsG . These results show that the ptsG-encoded EIIGlc is part of a novel mechanism for perception of intracellular glucose-6-P accumulation and instantaneous inhibition of EIISuc-mediated sucrose uptake in C. glutamicum . This novel mode of control of PTS activity by an early glycolytic metabolite probably allows efficient adaptation of sugar uptake to the capacity of the central metabolism during co-metabolization, which is characteristic for C. glutamicum .