Abstract Patients with human papillomavirus (HPV+)–associated head and neck cancer (HNC) show significantly improved survival outcome compared with those with HPV-negative (HPV−) tumors. Published data examining this difference offers conflicting results to date. We systematically investigated the radiation sensitivity of all available validated HPV+ HNC cell lines and a series of HPV− HNC cell lines using in vitro and in vivo techniques. HPV+ HNCs exhibited greater intrinsic radiation sensitivity (average SF2 HPV−: 0.59 vs. HPV+: 0.22; P < 0.0001), corresponding with a prolonged G2–M cell-cycle arrest and increased apoptosis following radiation exposure (percent change 0% vs. 85%; P = 0.002). A genome-wide microarray was used to compare gene expression 24 hours following radiation between HPV+ and HPV− cell lines. Multiple genes in TP53 pathway were upregulated in HPV+ cells (Z score 4.90), including a 4.6-fold increase in TP53 (P < 0.0001). Using immortalized human tonsillar epithelial (HTE) cells, increased radiation sensitivity was seen in cell expressing HPV-16 E6 despite the effect of E6 to degrade p53. This suggested that low levels of normally functioning p53 in HPV+ HNC cells could be activated by radiation, leading to cell death. Consistent with this, more complete knockdown of TP53 by siRNA resulted in radiation resistance. These results provide clear evidence, and a supporting mechanism, for increased radiation sensitivity in HPV+ HNC relative to HPV− HNC. This issue is under active investigation in a series of clinical trials attempting to de-escalate radiation (and chemotherapy) in selected patients with HPV+ HNC in light of their favorable overall survival outcome. Cancer Res; 73(15); 4791–800. ©2013 AACR.

Abstract The centrosome is the main microtubule organizing center of the cell and is crucial for mitotic spindle assembly, chromosome segregation, and cell division. Centrosome duplication is tightly controlled, yet several pathogens, most notably oncogenic viruses, perturb this process leading to increased centrosome numbers. Infection by the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis ( C.t. ) correlates with blocked cytokinesis, supernumerary centrosomes, and multipolar spindles; however, the mechanisms behind how C.t. induces these cellular abnormalities from the confines of its inclusion, remain largely unknown. Here we show that the type III secreted effector protein, CteG, binds to centrin-2 (CETN2), a key structural component of centrosomes and regulator of centriole duplication. This interaction requires a functional calcium binding EF hand 4 of CETN2, which is recognized via the C-terminus of CteG. Significantly, we show that deletion of CteG, or knockdown of CETN2, significantly impairs chlamydia’s ability to induce centrosome amplification. Uniquely, we have identified the first bacterial effector to target centrins, crucial regulators of the eukaryotic cell cycle. These findings have not only allowed us to begin addressing how C.t. induces gross cellular abnormalities during infection, but also indicate that obligate intracellular bacteria may contribute to cellular transformation events that negatively impact host physiology even when the pathogen is long removed. Understanding the consequences of CteG-CETN2 interactions, its impact on centrosome amplification, and the long-term effect this has on host cells could explain why chlamydial infection leads to an increased risk of cervical or ovarian cancer. Significance Statement The presence of more than two centrosomes is a hallmark of many types of cancer, including cervical and ovarian cancers of which Chlamydia trachomatis ( C.t. ) infection is a significant risk factor. Despite the importance of this problem, how C.t. orchestrates these drastic changes in the host cell remains poorly understood. Here, we describe how C.t. uses a single effector protein, CteG, to drive centrosome amplification via manipulation of a key regulator of centriole duplication, centrin-2. This work begins to define how C.t. induces centrosome amplification to promote its replication while potentially contributing to devastating long-term negative consequences for normal host physiology. Further it may help elucidate why chlamydial infection leads to an increased cancer risk.

Adipose tissue plays a crucial role in metabolic syndrome, autoimmune diseases, and many cancers. Because of adipose's role in so many aspects of human health, there is a critical need for in vitro models that replicate adipose architecture and function. Traditional monolayer models, despite their convenience, are limited, showing heterogeneity and functional differences compared to 3D models. While monolayer cultures struggle with detachment and inefficient differentiation, healthy adipocytes in 3D culture accumulate large lipid droplets, secrete adiponectin, and produce low levels of inflammatory cytokines. The shift from monolayer models to more complex 3D models aims to better replicate the physiology of healthy adipose tissue in culture. This study introduces a simple and accessible protocol for generating adipose organoids using a scaffold-free spheroid model. The method, utilizing either 96-well spheroid plates or agarose micromolds, demonstrates increased throughput, uniformity, and ease of handling compared to previous techniques. This protocol allows for diverse applications, including drug testing, toxin screening, tissue engineering, and co-culturing. The choice between the two methods depends on the experimental goals, with the 96-well plate providing individualized control and the micromold offering scale advantages. The outlined protocol covers isolation, expansion, and characterization of stromal vascular fraction cells, followed by detailed steps for spheroid formation and optional downstream analyses.

ABSTRACT PCBs accumulate in adipose where they may impact the growth and function of cells within the tissue. This is particularly concerning during adolescence when adipocytes expand rapidly. Herein we sought to understand how exposure to PCB mixtures found in U.S. schools affects human adipose mesenchymal stem/stromal cell (MSC) health and function. We investigated how exposure to Aroclor 1016 and Aroclor 1254, as well as a newly characterized non-Aroclor mixture that resembles the PCB profile found in cabinets, Cabinet Mixture, affects adipose MSC growth, viability, and function in vitro. We found that exposure to all three mixtures resulted in two distinct types of toxicity. At PCB concentrations >20 μM, the majority of MSCs die, while at 1-10 μM MSCs remained viable but display numerous alterations to their phenotype. At these sublethal concentrations, MSC rate of expansion slowed, and morphology changed. Further assessment revealed PCB-exposed MSCs had impaired adipogenesis and a modest decrease in immunosuppressive capabilities. Thus, exposure to PCB mixtures found in schools negatively impacts the health and function of adipose MSCs. This work has implications for human health due to MSCs’ role in supporting the growth and maintenance of adipose tissue. SYNOPSIS PCB mixtures found in schools are toxic to human adipose mesenchymal stem/stromal cells, stunting their growth and altering their function in ways that could contribute to metabolic diseases.

Abstract Adipocytes regulate tissues through production of adipokines that can act both locally and systemically. Adipocytes also have been found to play a critical role in regulating the healing process. To better understand this role, we developed a 3D human adipocyte spheroid system that has an adipokine profile similar to in vivo adipose tissues. Previously, we found that conditioned medium from these spheroids induces human dermal fibroblast conversion into highly contractile, collagen producing myofibroblasts through a transforming growth factor beta-1 (TGF-β1) independent pathway. Here, we sought to identify how mature adipocytes signal to dermal fibroblasts through adipokines to induce myofibroblast conversion. By using molecular weight fractionation, heat inactivation, and lipid depletion, we determined mature adipocytes secrete a factor that is 30-100 kDa, heat labile, and lipid associated that induces myofibroblast conversion. We also show that depletion of the adipokine adiponectin, which fits those physiochemical parameters, eliminates the ability of adipocyte conditioned media to induce fibroblast to myofibroblast conversion. Interestingly, native adiponectin secreted by cultured adipocytes consistently elicited a stronger level of α -SMA expression than exogenously added adiponectin. Thus, adiponectin secreted by mature adipocytes induces fibroblast to myofibroblast conversion and may lead to a phenotype of myofibroblasts distinct from TGF-β1 induced myofibroblasts.

Ebola virus (EBOV) causes severe human disease. During late infection, EBOV virions are on the skin’s surface; however, the permissive skin cell types and the route of virus translocation to the epidermal surface are unknown. We describe a human skin explant model and demonstrate that EBOV infection of human skin via basal media increases in a time-dependent and dose-dependent manner. In the dermis, cells of myeloid, endothelial, and fibroblast origin were EBOV antigen–positive whereas keratinocytes harbored virus in the epidermis. Infectious virus was detected on the apical epidermal surface within 3 days, indicating that virus propagates and traffics through the explants. Purified human fibroblasts and keratinocytes supported EBOV infection ex vivo and both cell types required the phosphatidylserine receptor, AXL, and the endosomal protein, NPC1, for virus entry. This platform identified susceptible cell types and demonstrated dynamic trafficking of EBOV virions. These findings may explain person-to-person transmission via skin contact.

Abstract IAV utilize sialic acid (Sia) containing cell surface glycoconjugates for host cell infection, and IAV strains from different host species show preferences for structurally distinct Sia at the termini of glycoconjugates. Various types of cell surface glycoconjugates (N-glycans, O-glycans, glycolipids) display significant diversity in both structure and carbohydrate composition. To define the types of glycoconjugates that facilitate IAV infection, we utilized the CRISPR/Cas9 technique to truncate different types of glycoconjugates, either individually or in combination, by targeting glycosyltransferases essential to glycan biosynthesis in a human lung epithelial cell line. Our studies show that both human and avian IAV strains do not display strict preferences for a specific type of glycoconjugate. Interestingly, truncation of all three types of glycoconjugates significantly decreased the replication of human IAV strains, yet did not impact the replication of avian IAV strains. Taken together, our studies demonstrate that avian IAV strains utilize a broader repertoire of glycoconjugates for host cell infection as compared to human IAV strains. Author Summary It is well known that influenza A viruses (IAV) initiate host cell infection by binding to sialic acid, a sugar molecule present at the ends of various sugar chains called glycoconjugates. These glycoconjugates can vary in chain length, structure, and composition. However, it remains unknown if IAV strains preferentially bind to sialic acid on specific glycoconjugates for host cell infection. Here, we utilized CRISPR gene editing to abolish sialic acid on different glycoconjugate types in human lung cells, and evaluated human versus avian IAV infections. Our studies show that both human and avian IAV strains can infect human lung cells by utilizing any of the three major sialic acid-containing glycoconjugate types, specifically N-glycans, O-glycans, and glycolipids. Interestingly, simultaneous elimination of sialic acid on all three glycoconjugate types in human lung cells dramatically decreased human IAV infection, yet had little effect on avian IAV infection. Our studies indicate that avian IAV strains can utilize a wide variety of glycoconjugates for infection, whereas human IAV strains display restrictions in glycoconjugate type usage. These novel studies show distinct differences in host glycoconjugate preferences between human and avian IAV strains.