Abstract Migrasomes are recently discovered signalling organelles, enriched with tetraspanin proteins (TSPAN) 1 . They form by local swelling of retraction fibers, the cylindrical protrusions of cell membranes that form as a result of cell migration along external substrates. Migrasomes can grow up to several micrometers in diameter 2 , and allow cells to release contents such as chemokines at specific locations, hence, transmitting signals to surrounding cells through the relevant chemokine receptors. Recently, evidence emerged showing that migrasomes play essential roles in fundamental cellular processes such transfer of mRNA and proteins 3 , organ morphogenesis 4 , and mitochondria quality control 5 . Thus, understanding the mechanism of migrasome biogenesis is of outstanding importance. Previously, it was established that the molecules crucial for migrasome formation are tetraspanin proteins and cholesterol forming macrodomains in the migrasome membrane, while the physical forces driving local swelling of the retraction fibers originate from membrane tension and bending rigidity 1 . Yet, it remained unknown how and in which time sequence these factors are involved in migrasome nucleation, growth, and stabilization, and what are the possible intermediate stages of migrasome biogenesis.

Abstract Multiple membrane shaping and remodelling processes are associated with tetraspanin proteins by yet unknown mechanisms. Tetraspanins constitute a family of proteins with four transmembrane domains present in high copy numbers in every cell type. Prominent examples are tetraspanin4 and CD9 that are required for the fundamental cellular processes of migrasome formation and fertilization, respectively. These proteins are enriched in curved membrane structures, such as cellular retraction fibers and oocyte microvilli. The factors driving this enrichment are, however, unknown. Here we revealed that tetrasapnin4 and CD9 are curvature sensors with a preference for positive membrane curvature. To this end we used a biomimetic system emulating membranes of cell retraction fibers and oocyte microvilli by membrane tubes pulled out of giant plasma membrane vesicles with controllable membrane tension and curvature. We developed a simple thermodynamic model for the partitioning of curvature sensors between flat and tubular membranes, which allowed us to estimate the individual intrinsic curvatures of the two proteins. Overall, our findings illuminate the process of migrasome formation and oocyte microvilli shaping and provide insight into the role of tetraspanin proteins in membrane remodelling processes.