Abstract Next-generation sequencing has led to a dramatic improvement in molecular diagnoses of serious pediatric disorders caused by apparently de novo mutations (DNMs); by contrast, clinicians’ ability to counsel the parents about the risk of recurrence in a future child has lagged behind. Owing to the possibility that one of the parents could be mosaic in their germline, a recurrence risk of 1-2% is frequently quoted, but for any specific couple, this figure is usually incorrect. We present a systematic approach to providing individualized recurrence risk stratification, by combining deep-sequencing of multiple tissues in the mother-father-child trio with haplotyping to determine the parental origin of the DNM. In the first 58 couples analysed (total of 59 DNMs in 49 different genes), the risk for 35 (59%) DNMs was decreased below 0.1% but for 6 (10%) couples it was increased owing to parental mosaicism - that could be quantified in semen (recurrence risks of 5.6-12.1%) for the paternal cases. Deep-sequencing of the DNM efficiently identifies couples at greatest risk for recurrence and may qualify them for additional reproductive technologies. Haplotyping can further reassure many other couples that their recurrence risk is very low, but its implementation is more technically challenging and will require better understanding of how couples respond to information that reduces their risks.

Abstract The homology, recombination, variation, and repetitive elements in the natural killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) region has made full haplotype DNA interpretation impossible without physical separation of chromosomes. Here, we present a new approach using long-read sequencing to efficiently capture, sequence, and assemble diploid human KIR haplotypes. Sequences for capture probe design were derived from public full-length gene and haplotype sequences. IDT xGen® Lockdown probes were used to capture 2-8 kb of sheared DNA fragments followed by sequencing on a PacBio Sequel. The sequences were error corrected, binned, and then assembled using the Canu assembler. The assembly was evaluated on 16 individuals (8 African American and 8 Europeans) from whom ground truth was known via long-range sequencing on fosmid-isolated chromosomes. Using only 18 capture probes, the results show that the assemblies cover 97% of the GenBank reference, are 99.97% concordant, and it takes only 1.8 contigs to cover 75% of the reference. We also report the first assembly of diploid KIR haplotypes from long-read WGS, including the first sequencing of cB05∼tB01, which pairs a KIR2DS2 / KIR2DS3 fusion with the tB01 region. Our targeted hybridization probe capture and sequencing approach is the first of its kind to fully sequence and phase all diploid human KIR haplotypes, and it is efficient enough for population-scale studies and clinical use.