Cyanobacterial flavodiiron proteins (FDPs; A-type flavoprotein, Flv) comprise, besides the β-lactamase-like and flavodoxin domains typical for all FDPs, an extra NAD(P)H:flavin oxidoreductase module and thus differ from FDPs in other Bacteria and Archaea. Synechocystis sp. PCC 6803 has four genes encoding the FDPs. Flv1 and Flv3 function as an NAD(P)H:oxygen oxidoreductase, donating electrons directly to O2 without production of reactive oxygen species. Here we show that the Flv1 and Flv3 proteins are crucial for cyanobacteria under fluctuating light, a typical light condition in aquatic environments. Under constant-light conditions, regardless of light intensity, the Flv1 and Flv3 proteins are dispensable. In contrast, under fluctuating light conditions, the growth and photosynthesis of the Δflv1(A) and/or Δflv3(A) mutants of Synechocystis sp. PCC 6803 and Anabaena sp. PCC 7120 become arrested, resulting in cell death in the most severe cases. This reaction is mainly caused by malfunction of photosystem I and oxidative damage induced by reactive oxygen species generated during abrupt short-term increases in light intensity. Unlike higher plants that lack the FDPs and use the Proton Gradient Regulation 5 to safeguard photosystem I, the cyanobacterial homolog of Proton Gradient Regulation 5 is shown not to be crucial for growth under fluctuating light. Instead, the unique Flv1/Flv3 heterodimer maintains the redox balance of the electron transfer chain in cyanobacteria and provides protection for photosystem I under fluctuating growth light. Evolution of unique cyanobacterial FDPs is discussed as a prerequisite for the development of oxygenic photosynthesis.

Abstract A fundamental limitation of photosynthetic carbon fixation is the availability of CO 4 . In C 4 plants, primary carboxylation occurs in mesophyll cytosol, and little is known about the role of CO 2 diffusion in facilitating C 4 photosynthesis. We have examined the expression, localization, and functional role of selected plasma membrane intrinsic aquaporins (PIPs) from Setaria italica (foxtail millet) and discovered that SiPIP2;7 is CO 2 -permeable. When ectopically expressed in mesophyll cells of S. viridis (green foxtail), SiPIP2;7 was localized to the plasma membrane and caused no marked changes in leaf biochemistry. Gas-exchange and C 18 O 16 O discrimination measurements revealed that targeted expression of SiPIP2;7 enhanced the conductance to CO 2 diffusion from the intercellular airspace to the mesophyll cytosol. Our results demonstrate that mesophyll conductance limits C 4 photosynthesis at low p CO 2 and that SiPIP2;7 is a functional CO 2 permeable aquaporin that can improve CO 2 diffusion at the airspace/mesophyll interface and enhance C 4 photosynthesis.

Abstract Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) is one of the rate-limiting enzymes of the Calvin cycle, and, in C 3 plants, increasing the abundance of SBPase is known to provide higher photosynthetic rates and stimulate biomass and yield. C 4 plants usually have higher photosynthetic rates because they operate a biochemical CO 2 concentrating mechanism between mesophyll and bundle sheath cells. In the C 4 system, SBPase and other enzymes of Calvin cycle are localised to the bundle sheath cells. Here we tested what effect increasing abundance of SBPase would have on C 4 photosynthesis. Using Setaria viridis , a model C 4 plant of NADP-ME subtype, we created transgenic plants with 1.5 to 3.2-times higher SBPase content, compared to wild type plants. Transcripts of the transgene were found predominantly in the bundle sheaths suggesting the correct cellular localisation of the protein. Abundance of RBCL, the large subunit of Rubisco, was not affected in transgenic plants overexpressing SBPase, and neither was relative chlorophyll content or photosynthetic electron transport parameters. We found no correlation between SBPase content in S. viridis and saturating rates of CO 2 assimilation. Moreover, detailed analysis of CO 2 assimilation rates at different CO 2 partial pressure, irradiance and leaf temperature, showed no improvement of photosynthesis in plants overexpressing SBPase. We discuss potential implications of these results for understanding the regulation of C 4 photosynthesis.

Abstract C 4 photosynthesis is a biochemical pathway that operates across mesophyll and bundle sheath (BS) cells to increase CO 2 concentration at the site of CO 2 fixation. C 4 plants benefit from high irradiance but their efficiency decreases under shade causing a loss of productivity in crop canopies. We investigated shade acclimation responses of a model NADP-ME monocot Setaria viridis focussing on cell-specific electron transport capacity. Plants grown under low light (LL) maintained CO 2 assimilation rates similar to high light plants but had an increased chlorophyll and light-harvesting-protein content, predominantly in BS cells. Photosystem II (PSII) protein abundance, oxygen-evolving activity and the PSII/PSI ratio all increased in LL BS cells indicating a higher capacity for linear electron flow. PSI, ATP synthase, Cytochrome b 6 f and the chloroplastic NAD(P) dehydrogenase complex, which constitute the BS cyclic electron flow machinery, were all upregulated in LL plants. A decline in PEP carboxylase activity in mesophyll cells and a consequent shortage of reducing power in BS chloroplasts was associated with the more oxidised redox state of the plastoquinone pool in LL plants and the formation of PSII - light-harvesting complex II supercomplexes with an increased oxygen evolution rate. Our results provide evidence of a redox regulation of the supramolecular composition of Photosystem II in BS cells in response to shading. This newly identified link contributes to understanding the regulation of PSII activity in C 4 plants and will support strategies for crop improvement including the engineering of C 4 photosynthesis into C 3 plants. Significance statement The efficiency of C 4 photosynthesis decreases under low irradiance causing a loss of productivity in crop canopies. We investigate shade acclimation of a model NADP-ME monocot, analysing cell-specific protein expression and electron transport capacity. We propose a regulatory pathway controlling abundance and activity of Photosystem II in bundle sheath cells in response to irradiance.

Abstract When C 4 leaves are exposed to low light, CO 2 concentration in the bundle sheath (BS) cells decreases, causing an increase in photorespiration relative to assimilation, and a consequent reduction in biochemical efficiency. These effects can be mitigated by complex acclimation syndromes, which are of primary importance for crop productivity, but not well studied. We unveil an acclimation strategy involving regulation of electron transport processes. Firstly, we characterise anatomy, gas-exchange and electron transport of C 4 Setaria viridis grown under low light. Through a purposely developed biochemical model, we resolve the photon fluxes and reaction rates to explain how the concerted acclimation strategies sustain photosynthetic efficiency. Our results show that a smaller BS in low light-grown plants limited leakiness (the ratio of CO 2 leak rate out of the BS over the rate of supply via C 4 acid decarboxylation) but sacrificed light harvesting and ATP production. To counter ATP shortage and maintain high assimilation rates, plants facilitated light penetration through the mesophyll and upregulated cyclic electron flow in the BS. This shade tolerance mechanism based on optimisation of light reactions is potentially more efficient than the known mechanisms involving the rearrangement of carbon metabolism, and can potentially lead to innovative strategies for crop improvement. Significance We mechanistically link the optical cross-section of leaf compartments with the rate of electron transport, the engagement of cyclic electron flow, the relative rate of ATP and NADPH generation, and fluxes through the carbon metabolism. The striking capacity of Setaria viridis to counter the decrease in light absorption in the bundle sheath with an increase of cyclic electron flow presents perhaps the most efficient mechanism of shade acclimation.

The superior productivity of C4 plants is achieved via a metabolic C4 cycle which acts as a COC2 pump across mesophyll and bundle sheath (BS) cells and requires an additional input of energy in the form of ATP. Chloroplast NADH dehydrogenase-like complex (NDH) increases ATP production in C3 plants by operating cyclic electron flow (CEF) around Photosystem I (PSI), and its importance for C4 photosynthesis has been proposed from evolutionary and reverse genetics studies. We used the gene-edited C4 species Setaria viridis with null ndhO alleles lacking NDH to study a contribution of the complex to the cell-level electron transport. Our results indicate that NDH is the primary PSI electron acceptor mediating the majority of CEF in BS cells whilst the contribution of the complex to CEF in mesophyll cells is minimal. Moreover, the reduced leaf COC2 assimilation rate and growth of plants lacking the complex cannot be rescued by supplying additional COC2, indicating that NDH is essential for generating ATP required for COC2 fixation by the C3 cycle. Hereby we resolve a cell-level mechanism for the contribution of NDH to supporting high COC2 assimilation rates in C4 photosynthesis.

Abstract Photosynthesis is fundamental for plant growth and yield. The Cytochrome b 6 f complex catalyses a rate-limiting step in thylakoid electron transport and therefore represents an important point of regulation of photosynthesis. Here we show that overexpression of a single core subunit of Cytochrome b 6 f , the Rieske FeS protein, led to up to a 40% increase in the abundance of the complex in Nicotiana tabacum (tobacco) and was accompanied by an enhanced in vitro Cytochrome f activity, indicating a full functionality of the complex. Analysis of transgenic plants overexpressing Rieske FeS by the light-induced fluorescence transients technique revealed a more oxidised primary quinone acceptor of Photosystem II (Q A ) and plastoquinone pool and a faster electron transport from the plastoquinone pool to Photosystem I upon changes in irradiance, compared to control plants. A faster establishing of q E , the energy-dependent component of non-photochemical quenching, in transgenic plants suggested a more rapid build-up of the transmembrane proton gradient, also supporting the increased in vivo Cytochrome b 6 f activity. However, there was no consistent increase in steady-state rates of electron transport or CO 2 assimilation in plants overexpressing Rieske FeS grown in either laboratory conditions or in field trials, suggesting that the in vivo activity of the complex was only transiently increased upon changes in irradiance. Our results show that overexpression of Rieske FeS in tobacco enhances abundance of functional Cytochrome b 6 f and electron transport capacity and may have a potential to increase plant productivity if combined with other traits. One-sentence summary Increased abundance of Cytochrome b 6 f complex leads to transient increases in photosynthetic electron transport rate in tobacco.

Abstract Sorghum is one of the most important crops providing food and feed in many of the world’s harsher environments. Sorghum utilises the C 4 pathway of photosynthesis in which a biochemical carbon concentrating mechanism results in high CO 2 assimilation rates. Overexpressing the Rieske subunit of the Cytochrome b 6 f complex was previously shown to increase the rate of photosynthetic electron transport and stimulate CO 2 assimilation in the model C 4 plant Setaria viridis . To test whether productivity of C 4 crops could be improved by Rieske overexpression, we created transgenic Sorghum bicolor plants with increased Rieske content. The transgenic plants showed no marked changes in abundance of other photosynthetic proteins or chlorophyll content. Increases in yield of Photosystem II and CO 2 assimilation rate as well as faster responses of non-photochemical quenching during transient photosynthetic responses were observed as a result of an elevated in vivo Cytochrome b 6 f activity in plants overexpressing Rieske. The steady-state rates of electron transport and CO 2 assimilation did not differ between transgenic and control plants, suggesting that Cytochrome b 6 f is not the only factor limiting electron transport in sorghum at high light and high CO 2 . Nevertheless, more agile responses of photosynthesis to light transitions led to increases in biomass and grain yield in plants overexpressing Rieske. Our results indicate that increasing Rieske content could boost productivity of C 4 crops by improving the efficiency of light utilisation and conversion to biomass.

Photosynthetic manipulation provides new opportunities for enhancing crop yield. However, understanding and quantifying effectively how the seasonal growth and yield dynamics of target crops might be affected over a wide range of environments is limited. Using a state-of-the-art cross-scale model we predicted crop-level impacts of a broad list of promising photosynthesis manipulation strategies for C3 wheat and C4 sorghum. The manipulation targets have varying effects on the enzyme-limited (Ac) and electron transport-limited (Aj) rates of photosynthesis. In the top decile of seasonal outcomes, yield gains with the list of manipulations were predicted to be modest, ranging between 0 and 8%, depending on the crop type and manipulation. To achieve the higher yield gains, large increases in both Ac and Aj are needed. This could likely be achieved by stacking Rubisco function and electron transport chain enhancements or installing a full CO2 concentrating system. However, photosynthetic enhancement influences the timing and severity of water and nitrogen stress on the crop, confounding yield outcomes. Strategies enhancing Ac alone offers more consistent but smaller yield gains across environments, Aj enhancement alone offers higher gains but is undesirable in less favourable environments. Understanding and quantifying complex cross-scale interactions between photosynthesis and crop yield will challenge and stimulate photosynthesis and crop research.

Summary The model heterocyst-forming filamentous cyanobacterium, Anabaena sp. PCC 7120 ( Anabaena ) represents multicellular organisms capable of simultaneously performing oxygenic photosynthesis in vegetative cells and the O 2 -sensitive N 2 -fixation inside the heterocysts. The flavodiiron proteins (FDPs) have been shown to participate in photoprotection of photosynthesis by driving excess electrons to O 2 (Mehler-like reaction). Here, we addressed the physiological relevance of the vegetative cell-specific Flv1A and Flv3A on the bioenergetic processes occurring in diazotrophic Anabaena under variable CO 2 . We demonstrate that both Flv1A and Flv3A are required for proper induction of the Mehler-like reaction upon a sudden increase in light intensity, which is likely important for the activation of carbon-concentrating mechanisms (CCM) and CO 2 fixation. Under ambient CO 2 diazotrophic conditions, Flv3A is capable of mediating moderate O 2 photoreduction, independently of Flv1A, but in coordination with Flv2 and Flv4. Strikingly, the lack of Flv3A resulted in strong downregulation of the heterocyst-specific uptake hydrogenase, which led to enhanced H 2 photoproduction under both oxic and micro-oxic conditions. These results reveal a novel regulatory network between the Mehler-like reaction and the diazotrophic metabolism, which is of great interest for future biotechnological applications.