Abstract Integrons are adaptive bacterial devices that rearrange promoter less gene cassettes into variable ordered arrays under stress conditions, to sample combinatorial phenotypic diversity. Chromosomal integrons often carry hundreds of silent gene cassettes, with integrase-mediated recombination leading to rampant DNA excision and integration, posing a potential threat to genome integrity. How this activity is regulated and controlled, particularly through selective pressures, to maintain such large cassette arrays is unknown. Here we show a key role of promoter-containing toxin–antitoxin (TA) cassettes as abortive systems that kill the cell when the overall cassette excision rate is too high. These results highlight the importance of TA cassettes regulating the cassette recombination dynamics and provide insight into the evolution and success of integrons in bacterial genomes. Teaser The accumulation of cassette functions in integrons is ensured by toxin–antitoxin systems which kill the cell when the cassette excision rate is too high.

Abstract Integrons are genetic elements involved in bacterial adaptation. They can capture, shuffle and express adaptive functions embedded in cassettes. These events are governed by the integron integrase through site-specific recombination between attC and attI integron sites. Here, we demonstrated that the integrase can efficiently catalyze insertion of cassettes in bacterial genomes, outside the att sites. We showed that, once inserted in genomes, cassettes can be expressed, if located near bacterial promoters, and can be excised at the insertion point and even outside, inducing chromosomal modifications in the latter case. Analysis of more than 5 × 10 5 independent insertion events revealed a very large genomic insertion landscape with recombination sites greatly different, in terms of sequence and structure, from classical att sites. We named these new sites attG . These results unveil a new efficient route for dissemination of adaptive functions and expand the role of integrons in bacterial evolution.

Abstract Integrons are adaptive devices that capture, stockpile, shuffle and express gene cassettes thereby sampling combinatorial phenotypic diversity. Some integrons called sedentary chromosomal integrons (SCIs) can be massive structures containing hundreds of cassettes. Since most of these cassettes are non-expressed, it is not clear how they remain stable over long evolutionary timescales. Recently, it was found that the experimental inversion of the SCI of Vibrio cholerae led to a dramatic increase of the cassette excision rate associated to a fitness defect. Here, we question the evolutionary sustainability of this apparently counter selected genetic context through experimental evolution. We find that the integrase is rapidly inactivated and that the inverted SCI can recover its original orientation by homologous recombination between two insertion sequences (ISs) present in the array. These two outcomes of SCI inversion restore the normal growth and prevent the loss of cassettes, enabling SCIs to retain their roles as reservoirs of functions. These results illustrate an interesting interplay between gene orientation, genome rearrangement, bacterial fitness and demonstrate how integrons can benefit from their embedded ISs.

Abstract Integrons are genetic systems conferring to bacteria a rapid adaptation capability. The integron integrase is able to capture, stockpile and shuffle novel functions embedded in cassettes. This involves the recognition of both substrates, the attI site, and the cassette associated attC sites. Integrons can be sedentary and chromosomally located (SCI) or, carried by conjugative plasmids (Mobile Integron, MI), hence favoring their dissemination among bacteria. Here, for the first time, we investigate the cassette recruitment in the Vibrio cholerae SCI during conjugation and natural transformation. We demonstrated that horizontally transferred cassette can be recruited inside the chromosomal integron. The endogenous integrase expression is sufficiently triggered, after SOS response induction mediated by the entry of single-stranded cassettes during conjugation and natural transformation, to mediate significant cassette insertion. We demonstrate that the attIA insertion is preferential, despite the presence of 180 attC sites in the integron array. Thanks to the presence of a promoter in the attIA site vicinity, all these newly inserted cassettes are expressed and prone to adaptive selection. We also show that the RecA protein is critical for cassette recruitment in V. cholerae SCI but not in MIs. Moreover, a contrario to MIs, the V. cholerae SCI is not active in others bacterial hosts. MIs might have evolved from the SCIs by overcoming host factors, which would explain their large dissemination in bacteria and their role in the antibioresistance expansion.

Transposon-encoded tnpB genes encode RNA-guided DNA nucleases that promote their own selfish spread through targeted DNA cleavage and homologous recombination. This widespread gene family was repeatedly domesticated over evolutionary timescales, leading to the emergence of diverse CRISPR-associated nucleases including Cas9 and Cas12. We set out to test the hypothesis that TnpB nucleases may have also been repurposed for novel, unexpected functions other than CRISPR-Cas. Here, using phylogenetics, structural predictions, comparative genomics, and functional assays, we uncover multiple instances of programmable transcription factors that we name TnpB-like nuclease-dead repressors (TldR). These proteins employ naturally occurring guide RNAs to specifically target conserved promoter regions of the genome, leading to potent gene repression in a mechanism akin to CRISPRi technologies invented by humans. Focusing on a TldR clade found broadly in Enterobacteriaceae, we discover that bacteriophages exploit the combined action of TldR and an adjacently encoded phage gene to alter the expression and composition of the host flagellar assembly, a transformation with the potential to impact motility, phage susceptibility, and host immunity. Collectively, this work showcases the diverse molecular innovations that were enabled through repeated exaptation of genes encoded by transposable elements, and reveals that RNA-guided transcription factors emerged long before the development of dCas9-based editors.