Exosomes are attractive as nucleic-acid carriers because of their favourable pharmacokinetic and immunological properties and their ability to penetrate physiological barriers that are impermeable to synthetic drug-delivery vehicles. However, inserting exogenous nucleic acids, especially large messenger RNAs, into cell-secreted exosomes leads to low yields. Here we report a cellular-nanoporation method for the production of large quantities of exosomes containing therapeutic mRNAs and targeting peptides. We transfected various source cells with plasmid DNAs and stimulated the cells with a focal and transient electrical stimulus that promotes the release of exosomes carrying transcribed mRNAs and targeting peptides. Compared with bulk electroporation and other exosome-production strategies, cellular nanoporation produced up to 50-fold more exosomes and a more than 103-fold increase in exosomal mRNA transcripts, even from cells with low basal levels of exosome secretion. In orthotopic phosphatase and tensin homologue (PTEN)-deficient glioma mouse models, mRNA-containing exosomes restored tumour-suppressor function, enhanced inhibition of tumour growth and increased survival. Cellular nanoporation may enable the use of exosomes as a universal nucleic-acid carrier for applications requiring transcriptional manipulation. A cellular-nanoporation method produces large quantities of exosomes containing therapeutic mRNAs and targeting peptides that restore tumour-suppressor function in mice with orthotopically implanted phosphatase and tensin homologue (PTEN)-deficient brain gliomas.

Abstract A major rate-limiting step in developing more effective immunotherapies for GBM is our inadequate understanding of the cellular complexity and the molecular heterogeneity of immune infiltrates in gliomas. Here, we report an integrated analysis of 201,986 human glioma, immune, and other stromal cells at the single cell level. In doing so, we discover extensive spatial and molecular heterogeneity in immune infiltrates. We identify molecular signatures for nine distinct myeloid cell subtypes, of which five are independent prognostic indicators of glioma patient survival. Furthermore, we identify S100A4 as a regulator of immune suppressive T and myeloid cells in GBM and demonstrate that deleting S100a4 in non-cancer cells is sufficient to reprogram the immune landscape and significantly improve survival. This study provides insights into spatial, molecular, and functional heterogeneity of glioma and glioma-associated immune cells and demonstrates the utility of this dataset for discovering therapeutic targets for this poorly immunogenic cancer.

Abstract Nanomedicine is a burgeoning industry but an understanding of the interaction of nanomaterials with the immune system is critical for clinical translation. Macrophages play a fundamental role in the immune system by engulfing foreign particulates such as nanoparticles. When activated, macrophages form distinct phenotypic populations with unique immune functions, however the mechanism by which these polarized macrophages react to nanoparticles is unclear. Furthermore, strategies to selectively evade activated macrophage subpopulations are lacking. Here we demonstrate that stimulated macrophages possess higher phagocytic activities and that classically activated (M1) macrophages exhibit greater phagocytic capacity than alternatively activated (M2) macrophages. We show that modification of nanoparticles with polyethylene-glycol results in decreased clearance by all macrophage phenotypes, but importantly, coating nanoparticles with CD47 preferentially lowers phagocytic activity by the M1 phenotype. These results suggest that bio-inspired nanoparticle surface design may enable evasion of specific components of the immune system and provide a rational approach for developing immune tolerant nanomedicines.

Tumour cell phagocytosis by antigen presenting cells (APCs) is critical to the generation of antitumour immunity. However, cancer cells can evade phagocytosis by upregulating anti-phagocytosis molecule CD47. Here, we show that CD47 blockade alone is inefficient in stimulating glioma cell phagocytosis. However, combining CD47 blockade with temozolomide results in a significant pro-phagocytosis effect due to the latter's ability to induce endoplasmic reticulum stress response. Increased tumour cell phagocytosis subsequently enhances antigen cross-presentation and activation of cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes (cGAS-STING) in APCs, resulting in more efficient T cell priming. This bridging of innate and adaptive responses inhibits glioma growth, but also activates immune checkpoint. Sequential administration of an anti-PD1 antibody overcomes this potential adaptive resistance. Together, these findings reveal a dynamic relationship between innate and adaptive immune regulation in tumours and support further investigation of phagocytosis modulation as a strategy to enhance cancer immunotherapy responses.

Immune checkpoint blockade (ICB) has demonstrated curative potential in several types of cancer, but only for a small number of patients. Thus, the identification of reliable and noninvasive biomarkers for predicting ICB responsiveness is an urgent unmet need. Here, we show that ICB increased tumor vessel perfusion in treatment-sensitive EO771 and MMTV-PyVT breast tumor as well as CT26 and MCA38 colon tumor models, but not in treatment-resistant MCaP0008 and 4T1 breast tumor models. In the sensitive tumor models, the ability of anti–cytotoxic T lymphocyte–associated protein 4 or anti–programmed cell death 1 therapy to increase vessel perfusion strongly correlated with its antitumor efficacy. Moreover, globally enhanced tumor vessel perfusion could be detected by Doppler ultrasonography before changes in tumor size, which predicted final therapeutic efficacy with more than 90% sensitivity and specificity. Mechanistically, CD8+ T cell depletion, IFN-γ neutralization, or implantation of tumors in IFN-γ receptor knockout mice abrogated the vessel perfusion enhancement and antitumor effects of ICB. These results demonstrated that ICB increased vessel perfusion by promoting CD8+ T cell accumulation and IFN-γ production, indicating that increased vessel perfusion reflects the successful activation of antitumor T cell immunity by ICB. Our findings suggest that vessel perfusion can be used as a novel noninvasive indicator for predicting ICB responsiveness.

Abstract The physical and molecular heterogeneity of extracellular vesicles (EVs) confounds bulk biomarker characterization, thus encouraging the development of novel assays capable of profiling EVs at a single-vesicle resolution. Here, we present a single EV (siEV) protein and RNA assay ( siEV PRA) to simultaneously detect proteins, messenger RNAs (mRNAs), and microRNAs (miRNAs) in siEVs. The siEV PRA consists of an array of microdomains embedded on a polyethylene glycol (PEG)-coated glass surface produced via UV photopatterning, functionalized with antibodies to target siEV subpopulations. Fluorescently labeled antibodies and RNA-targeting molecular beacons (MBs) were used to generate signals for proteins, mRNAs, and miRNAs on siEVs detected by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), outperforming the sensitivities of ELISA and PCR by three orders of magnitude. Using the siEV PRA, we analyzed EVs harvested from glioblastoma (GBM) cell lines and demonstrated vesicular heterogeneity in protein, mRNA, and miRNA expression through colocalization analyses, and validated the results by bulk RNA sequencing. We further demonstrated the clinical utility of the siEV PRA by detecting different mRNAs and miRNAs associated with GBM in patient samples. Together, these results indicate that the siEV PRA provides an effective platform to investigate the heterogeneity of proteins and RNAs in subpopulations of EVs.

The success of messenger RNA therapeutics largely depends on the availability of delivery systems that enable the safe, effective and stable translation of genetic material into functional proteins. Here we show that extracellular vesicles (EVs) produced via cellular nanoporation from human dermal fibroblasts, and encapsulating mRNA encoding for extracellular-matrix α1 type-I collagen (COL1A1) induced the formation of collagen-protein grafts and reduced wrinkle formation in the collagen-depleted dermal tissue of mice with photoaged skin. We also show that the intradermal delivery of the mRNA-loaded EVs via a microneedle array led to the prolonged and more uniform synthesis and replacement of collagen in the dermis of the animals. The intradermal delivery of EV-based COL1A1 mRNA may make for an effective protein-replacement therapy for the treatment of photoaged skin.

2026 Background: Stereotactic radiosurgery (SRS) is an ablative modality for focal treatment of brain metastases (BM) and is standard of care for limited BM. Suitability for SRS has historically been linked to number of BM, with up to 4 BM considered amenable to SRS. JLGK0901 revealed no difference in overall survival (OS) and similar rates of adverse events for patients with 5-10 vs. 2-4 BM. Evidence supporting for SRS for >10 BM is limited. As systemic treatments have evolved to include agents with improved central nervous system (CNS) efficacy and OS, the role of SRS warrants re-evaluation. Methods: We retrospectively reviewed patients from a single institution with ≥5 BM treated with SRS with no prior history of brain radiation 2015-2022 on an IRB-approved protocol. Clinical history, including sex, histology, Karnofsky performance status (KPS), extracranial disease status and systemic regimen used before and after diagnosis of BM, was reviewed. Systemic regimens were categorized based on potential for CNS efficacy as 1) none: no evidence, 2) weak: single agent immunotherapy or known but limited data on CNS efficacy, or 3) strong: multiple agents with known CNS efficacy, single agents with strong CNS efficacy. Kaplan-Meier method was used to estimate survival with log-rank test used to evaluate differences in survival curves. Cox proportional hazards modeling was used to evaluate differences in CNS progression-free survival (CNS-PFS) and OS. Results: 558 patients (48% female) who received SRS to ≥5 BM (range 5-23) were identified. Primary histologies included: 36% non-small cell lung cancer; 22% melanoma; 14% breast; 7% renal; 5% gastrointestinal; 15% other. Median OS was 11.0 months and did not differ between patients with 5-9 (n=441) vs ≥10 BM (n=117) (median OS 11.1 vs. 10.0 months; p=0.53). Median CNS-PFS was 6.6 months and did not differ between 5-9 vs ≥ 10 BM (median CNS-PFS 6.4 vs. 7.7 p=0.86). On univariate analysis, high KPS (HR 0.96; p<0.001) was associated with improved OS. Histology ( p=0.14), BM number ( p=0.53); average BM volume ( p=0.48), and systemic disease status ( p=0.17) were not associated with OS. Change of systemic therapy at time of SRS was associated with improved OS (HR 0.58; p<0.001) and CNS-PFS (HR 0.63; p<0.001). Amongst patients with systemic therapy change, regimens with increased CNS efficacy compared to prior therapy were associated with improved OS (HR 0.59; p<0.001) and CNS-PFS (HR 0.65; p=0.002). Conclusions: In this large, retrospective analysis of patients with ≥ 5 previously untreated BM treated with SRS, we found no association between BM number and CNS-PFS or OS. Change in systemic therapy, particularly to agents with CNS efficacy, was associated with improved outcomes. While limited by biases inherent to retrospective analyses, these results suggest patients with larger number of BM (≥10) are appropriate for SRS, especially when changing to systemic therapy with CNS penetrance.