Abstract This paper describes outcomes of the 2019 Cryo-EM Map-based Model Metrics Challenge sponsored by EMDataResource ( www.emdataresource.org ). The goals of this challenge were (1) to assess the quality of models that can be produced using current modeling software, (2) to check the reproducibility of modeling results from different software developers and users, and (3) compare the performance of current metrics used for evaluation of models. The focus was on near-atomic resolution maps with an innovative twist: three of four target maps formed a resolution series (1.8 to 3.1 Å) from the same specimen and imaging experiment. Tools developed in previous challenges were expanded for managing, visualizing and analyzing the 63 submitted coordinate models, and several novel metrics were introduced. The results permit specific recommendations to be made about validating near-atomic cryo-EM structures both in the context of individual laboratory experiments and holdings of structure data archives such as the Protein Data Bank. Our findings demonstrate the relatively high accuracy and reproducibility of cryo-EM models derived from these benchmark maps by 13 participating teams, representing both widely used and novel modeling approaches. We also evaluate the pros and cons of the commonly used metrics to assess model quality and recommend the adoption of multiple scoring parameters to provide full and objective annotation and assessment of the model, reflective of the observed density in the cryo-EM map.

Abstract During its cytoplasmic replication, vaccinia virus assembles non-infectious spherical immature virions (IV) coated by a viral D13 lattice. Subsequently, IV mature into infectious brick-shaped intracellular mature virus (IMV) that lack D13. Here, we performed cryo-electron tomography of frozen-hydrated vaccinia-infected cells to structurally characterise the maturation process in situ. During IMV formation a new viral core forms inside IV with a wall consisting of trimeric pillars arranged in a new pseudohexagonal lattice. This lattice appears as a palisade in cross-section. During maturation, which involves a 50% reduction in virion volume, the viral membrane becomes corrugated as it adapts to the newly formed viral core in a process that does not appear to require membrane removal. Our study suggests that the length of this core is determined by the D13 lattice and that the consecutive D13 and palisade lattices control virion shape and dimensions during vaccinia assembly and maturation.

Abstract Through membrane sealing and disassembly of spindle microtubules, the Endosomal Sorting Complex Required for Transport-III (ESCRT-III) machinery has emerged as a key player in the regeneration of a sealed nuclear envelope (NE) during mitotic exit, and in the repair of this organelle during interphase rupture. ESCRT-III assembly at the NE occurs transiently during mitotic exit and is initiated when CHMP7, an ER-localised ESCRT-II/ESCRT-III hybrid protein, interacts with the Inner Nuclear Membrane (INM) protein LEM2. Whilst classical nucleocytoplasmic transport mechanisms have been proposed to separate LEM2 and CHMP7 during interphase, it is unclear how CHMP7 assembly is suppressed in mitosis when NE and ER identities are mixed. Here, we use live cell imaging and protein biochemistry to examine the biology of these proteins during mitotic exit. Firstly, we show that CHMP7 plays an important role in the dissolution of LEM2 clusters that form at the NE during M-exit. Secondly, we show that CDK1 phosphorylates CHMP7 upon mitotic entry at Ser3 and Ser441 and that this phosphorylation suppresses CHMP7’s interaction with LEM2, limiting its assembly during M-phase. We show that spatiotemporal differences in the dephosphorylation of CHMP7 license its assembly at the NE during telophase, but restrict its assembly on the ER at this time. Without CDK1 phosphorylation, CHMP7 undergoes inappropriate assembly in the peripheral ER during M-exit, capturing LEM2 and downstream ESCRT-III components. Lastly, we establish that a microtubule network is dispensable for ESCRT-III assembly at the reforming nuclear envelope. These data identify a key cell-cycle control programme allowing ESCRT-III-dependent nuclear regeneration.

Abstract Toxoplasma gondii glideosome-associated connector (GAC) is a giant armadillo-repeat protein, essential for parasite motility and conserved across Apicomplexa. It connects actin filaments to the plasma membrane via interactions with phosphatidic acid and membrane-spanning adhesins. It is unclear how GAC contributes to gliding motility and invasion and why such a large connector is needed. We determined the crystal structure of full-length T. gondii GAC at 2.3 Å resolution and explored its conformational space in solution using small-angle X-ray scattering and cryogenic electron microscopy. The crystal structure reveals a compact conformation but, in solution, GAC adopts both compact and extended forms. The PH domain stabilizes the compact form and may act as a switch triggered by membrane sensing. Based on its spring-like architecture, we suggest a role for GAC as an elastic element in actomyosin force generation during gliding motility and invasion.

One hurdle to understanding how molecular machines function and evolve is our inability to see their structures in situ. Here we describe a minicell system that enables in situ cryogenic electron microscopy imaging and single particle analysis to probe the mechanisms and evolution of an iconic molecular machine, the bacterial flagellar motor, which spins a helical propeller for bacterial propulsion. Innovations in sample preparation and imaging enabled resolutions sufficient to build an in situ molecular model of the C. jejuni flagellar motor. Our results provide unprecedented insights into the in situ context of flagellar motors, highlight origins of recruited components involved in the unusually high torque of the C. jejuni motor, identify previously unknown components, and reveal corresponding modifications of core components. We also visualise structures involved in torque generation and secretion previously recalcitrant to structure determination. This technique will be of broad applicability to other large membrane-residing protein complexes. Note that this manuscript has a sibling manuscript titled "Evolution of a large periplasmic disk in Campylobacterota flagella facilitated efficient motility alongside autoagglutination" that dissects the function of the large disk described in this manuscript.

Abstract Actins are filament-forming, highly-conserved proteins in eukaryotes. They are involved in essential processes in the cytoplasm and have also nuclear functions. Malaria parasites ( Plasmodium spp.) have two actin isoforms that differ from each other and from canonical actins in structure and filament-forming properties. Actin I has an essential role in motility and is fairly well characterized. The structure and function of actin II are not as well understood, but mutational analyses have revealed two essential functions in male gametogenesis and in the zygote. Here, we present expression analysis, high-resolution filament structures, and biochemical characterization of Plasmodium actin II. We show that it is expressed in male gametocytes and zygotes and associated with the nucleus in both stages in filament-like structures. Unlike actin I, actin II readily forms long filaments in vitro , and near-atomic structures in the presence or absence of jasplakinolide reveal very similar structures. Small but significant differences compared to other actins in the openness and twist, the active site, the D-loop, and the plug region contribute to filament stability. Mutational analyses suggest that long and stable filaments are necessary for male gametogenesis, while the second function in the zygote stage also requires finetuned regulation by methylation of histidine 73. Actin II polymerizes via the classical nucleation-elongation mechanism and has a critical concentration of ~0.1 μM at the steady-state, like actin I and canonical actins. Similarly to actin I, dimers are a stable form of actin II at equilibrium. Significance statement Malaria is a parasitic infection caused by Plasmodium spp., which belong to the phylum Apicomplexa. In 2020, approximately 627000 people died from nearly 241 million malaria cases registered worldwide. In contrast to other apicomplexan parasites, Plasmodium spp. encode two actin isoforms. While actin I is part of the glideosome complex, essential for locomotion, actin II is present in the mosquito stages, where it has functions in gametogenesis and in the zygote. The exact function of actin II is still unclear, and information at the molecular level is limited. We show here that actin II is associated with the nucleus in gametocytes and zygotes and performs specific functions requiring both long filaments and fine-tuning by methylation of histidine 73. We determined the structures of the filamentous form of actin II at near-atomic resolution and characterized its polymerization properties in vitro . Our study provides a molecular basis for the differences between actins of the malaria parasite and humans, as well as between the two parasite actin isoforms. Furthermore, the in vivo studies provide insights into the function of actin II in the parasite.