ABSTRACT Circulating mitochondrial DNA (cir-mtDNA) could have a potential comparable to circulating nuclear DNA (cir-nDNA), with numerous applications. However, research and development in this area have fallen behind, particularly considering its origin and structural features. To tackle this, we initially combined Q-PCR and low-pass whole genome sequencing in the same analytical strategy previously and successfully used for cir-nDNA. This revealed unexplained structural patterns and led us to correlate these data with observations made during physical examinations such as filtration, and differential centrifugation in various plasma preparations. Both the integrity index and number of reads revealed a very minor proportion of low size-ranged fragments (<1000 bp) in plasma obtained with a standard preparation (0.06%). Filtration and high speed second step centrifugation revealed that 98.7 and 99.4% corresponded to extracellular mitochondria either free or in large extracellular vesicles. When avoiding platelet activation during plasma preparation, the proportion of both types of entities was still preponderant (76-80%), but the amount of detected mitochondrial DNA decreased 67-fold. In correlation with our previous study on the presence of circulating cell-free mitochondria in blood, our differential centrifugation procedure suggested that cir-mtDNA is also associated with approximately 18% small extracellular vesicles, 1.7% exosomes and 4% protein complexes.

Abstract Background Because circulating DNA (cirDNA) are mainly detected as mononucleosome-associated circulating DNA (mono-N cirDNA) in blood apoptosis has until now been considered as the main source of cirDNA. The mechanism of cirDNA release into the circulation, however, is still not fully understood. This work addresses that knowledge gap, working from the postulate that neutrophil extracellular traps (NET) may be a source of cirDNA, and by investigating whether NET may directly produce mono-N cirDNA Methods We used the synergistic analytical information provided by specifically quantifying DNA by qPCR, and analyzing fragment size analysis by shallow WGS, and capillary electrophoresis to unequivocally study the following: the in vitro kinetics of cell derived genomic high molecular weight (gHMW) DNA degradation in serum; the production of extracellular DNA and NET markers such as neutrophil elastase (NE) and myeloperoxidase (MPO) by ex vivo activated neutrophils; in vitro NET degradation in serum. We also performed an in vivo study in knockout mice, and an in vitro study of gHMW DNA degradation, to elucidate the role of NE and MPO in effecting DNA degradation and fragmentation. We then compared the NET associated markers and fragmentation size profiles of cirDNA in plasma obtained from patients with inflammatory diseases found to be associated with NET formation and high levels of cirDNA (COVID-19, N= 28; systemic lupus erythematosus, N= 10; metastatic colorectal cancer, N= 10; and from healthy individuals, N= 114). Results Our studies reveal that: gHMW DNA degradation in serum results in the accumulation of mono-N DNA (81.3% of the remaining DNA following 24H incubation in serum corresponded to mono-N DNA); “ex vivo” NET formation, as demonstrated by a concurrent 5-, 5- and 35-fold increase of NE, MPO, and cell-free DNA (cfDNA) concentration in PMA-activated neutrophil culture supernatant, leads to the release of high molecular weight DNA that degrades down to mono-N in serum; NET mainly in the form of gHMW DNA generate mono-N cirDNA (2% and 41% of the remaining DNA after 2 hours in serum corresponded to 1-10 kbp fragments and mono-N, respectively) independent of any cellular process when degraded in serum; NE and MPO may contribute synergistically to NET autocatabolism, resulting in a 25-fold decrease in total DNA concentration and a DNA fragment size profile similar to that observed from cirDNA following 8h incubation with both NE and MPO; the cirDNA size profile of NE KO mice significantly differed from that of the WT, suggesting NE involvement in DNA degradation; and a significant increase in the levels of NE, MPO and cirDNA was detected in plasma samples from lupus, COVID-19 and mCRC, showing a high correlation with these inflammatory diseases, while no correlation of NE and MPO with cirDNA was found in HI. Conclusions Our work thus describes the mechanisms by which NET and cirDNA are linked, by demonstrating that NET are a major source of mono-N cirDNA independent of apoptosis, and thus establishing a new paradigm of the mechanisms of cirDNA release in normal and pathological conditions, as well as demonstrating a link between immune response and cirDNA.

6014 Background: EGFR is a known oncogenic driver in HNSCC, and the leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 (LGR5) is a receptor expressed on cancer stem cells, including in HNSCC. Petosemtamab is a human, common light chain, IgG1 bispecific antibody with ADCC-enhanced activity, targeting EGFR and LGR5. In the dose escalation part of a phase 1/2 study, the recommended phase 2 dose (RP2D) was determined to be 1500 mg every 2 weeks (Q2W). Interim data of petosemtamab monotherapy at the RP2D in 2L/3L HNSCC led to a 37.2% overall response rate (ORR; per investigator) with 6.0 months (mo) median duration of response (DOR) [Cohen, Cancer Research 2023]. Petosemtamab (RP2D) with pembrolizumab (400 mg Q6W) is being investigated in an expansion cohort of the ongoing phase 2 study (NCT03526835) in 1L HNSCC. Methods: Primary endpoints are safety and investigator-assessed ORR (RECIST v1.1). Secondary endpoints include DOR, progression-free survival (per investigator), and overall survival. Key eligibility criteria were r/m HNSCC with no prior systemic therapy, PD-L1 combined positive score ≥1, ECOG PS 0–1, measurable disease, and primary tumor location in oropharynx (regardless of p16 status), oral cavity, hypopharynx, or larynx. Results: No dose-limiting toxicities were observed in the safety run-in. As of a November 6, 2023 data cutoff, 26 pts were treated (24 continuing therapy at the data cutoff) and median follow-up was 1.35 mo. Median age was 62.5 years (range 23–80), ECOG PS 0/1 in 10/16 pts, and 65.4% were male. The most frequent primary tumor locations were oropharynx (34.6%), oral cavity (19.2%), and hypopharynx (19.2%). A median of 2 cycles (range 1–8) were administered. The combination was well tolerated and no significant overlapping toxicities were observed. Treatment-emergent adverse events (AEs) were reported in 26 pts, and most were Grade (G) 1 or 2 in severity (no G4–5 were observed). The most frequent AEs (all Gs/G3) were acneiform dermatitis (30.8%/0%), asthenia (26.9%/0%), and rash (26.9%/0%). Infusion-related reactions (composite term) were reported in 26.9% (all Gs) and 3.8% (G3) of pts, all occurred during the first infusion and resolved. Among 10 pts evaluable for efficacy (≥2 cycles and ≥1 post-baseline scan, or early progressive disease), there were 1 confirmed complete response, 2 confirmed and 3 unconfirmed partial responses (2 confirmed after data cutoff), 3 stable disease, and 1 progressive disease; with all 6 responders on treatment at data cutoff. Enrollment has been completed and updated data will be presented. Conclusions: Petosemtamab, a first-in-class EGFR x LGR5 bispecific antibody, in combination with pembrolizumab demonstrates a well-tolerated safety profile and promising preliminary clinical efficacy as 1L treatment for pts with r/m HNSCC. Clinical trial information: NCT03526835 .

The combination of bevacizumab and FOLFIRINOX is used in patients with RAS-mutant metastatic colorectal cancer (RASm-mCRC). Regorafenib, an oral multi-tyrosine kinase inhibitor, has antiangiogenic properties, cytostatic effects and also true cytotoxic effects, unlike bevacizumab. The aim of this study was to determine the maximum tolerated dose (MTD) and the recommended phase 2 dose (RP2D) of the regorafenib-FOLFIRINOX combination in patients with RASm-mCRC.

Abstract Background The Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) are often inadequate for the early assessment of the response to cancer therapy, particularly bevacizumab-based chemotherapy. In a first cohort of patients with colorectal cancer liver metastases (CRLM), we showed that variations of the tumor-to-liver density (TTLD) ratio and modified size-based criteria determined using computed tomography (CT) data at the first restaging were better prognostic criteria than the RECIST. The aims of this study were to confirm the relevance of these radiological biomarkers as early predictors of the long-term clinical outcome and to assess their correlation with contrast-enhanced ultrasound (CEUS) parameters in a new patient cohort. Methods In this post-hoc study of the multicenter STIC-AVASTIN trial, we retrospectively reviewed CT data of patients with CRLM treated with bevacizumab-based regimens. We determined the size, density and TTLD ratio of target liver lesions at baseline and at the first restaging and also performed a morphologic evaluation according to the MD Anderson criteria. We assessed the correlation of these parameters with progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) using the log-rank test and a Cox proportional hazard model. We also examined the association between TTLD ratio and quantitative CEUS parameters. Results This analysis concerned 79 of the 137 patients included in the STIC-AVASTIN trial. PFS and OS were significantly longer in patients with tumor size reduction > 15% at first restaging, but were not correlated with TTLD ratio variations. However, PFS was longer in patients with TTLD ratio > 0.6 at baseline and first restaging than in those who did not reach this threshold. In the multivariate analysis, only baseline TTLD ratio > 0.6 was a significant survival predictor. TTLD ratio > 0.6 was associated with improved perfusion parameters. Conclusions Although TTLD ratio variations did not correlate with the long-term clinical outcomes, TTLD absolute values remained a good predictor of survival at baseline and first restaging, and may reflect tumor microvascular features that might influence bevacizumab-based treatment efficiency. Trial registration NCT00489697, registration number of the STIC-AVASTIN trial.