The developmental signaling functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) are dependent on their sulfation states. Here, we report the identification of QSulf1, the avian ortholog of an evolutionarily conserved protein family related to heparan-specific N -acetyl glucosamine sulfatases. QSulf1 expression is induced by Sonic hedgehog in myogenic somite progenitors in quail embryos and is required for the activation of MyoD , a Wnt-induced regulator of muscle specification. QSulf1 is localized on the cell surface and regulates heparan-dependent Wnt signaling in C2C12 myogenic progenitor cells through a mechanism that requires its catalytic activity, providing evidence that QSulf1 regulates Wnt signaling through desulfation of cell surface HSPGs.

Hedgehogs (Hhs) are key signaling regulators of stem cell maintenance and tissue patterning in embryos, and activating mutations in the pathway that increase Gli transcriptional activity are causal in a diversity of cancers. Here, we report that phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase)-dependent Akt activation is essential for Sonic Hedgehog (Shh) signaling in the specification of neuronal fates in chicken neural explants, chondrogenic differentiation of 10T1/2 cells, and Gli activation in NIH 3T3 cells. Stimulation of PI3-kinase/Akt by insulin-like growth factor I potentiates Gli activation induced by low levels of Shh; however, insulin-like growth factor I alone is insufficient to induce Gli-dependent transcription. Protein kinase A (PKA) and glycogen synthase kinase 3β sequentially phosphorylate Gli2 at multiple sites, identified by mutagenesis, thus resulting in a reduction of its transcriptional activity. Gli2 mutant proteins in which the major PKA and glycogen synthase kinase 3β phosphorylation sites were mutated to alanine remain fully transcriptionally active; however, PKA-mutant Gli2 functions independently of Akt signaling, indicating that Akt positively regulates Shh signaling by controlling PKA-mediated Gli inactivation. Our findings provide a basis for the synergistic role of PI3-kinase/Akt in Hh signaling in embryonic development and Hh-dependent tumors.

The 6-O sulfation states of cell surface heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) are dynamically regulated to control the growth and specification of embryonic progenitor lineages. However, mechanisms for regulation of HSPG sulfation have been unknown. Here, we report on the biochemical and Wnt signaling activities of QSulf1, a novel cell surface sulfatase. Biochemical studies establish that QSulf1 is a heparan sulfate (HS) 6-O endosulfatase with preference, in particular, toward trisulfated IdoA2S-GlcNS6S disaccharide units within HS chains. In cells, QSulf1 can function cell autonomously to remodel the sulfation of cell surface HS and promote Wnt signaling when localized either on the cell surface or in the Golgi apparatus. QSulf1 6-O desulfation reduces XWnt binding to heparin and HS chains of Glypican1, whereas heparin binds with high affinity to XWnt8 and inhibits Wnt signaling. CHO cells mutant for HS biosynthesis are defective in Wnt-dependent Frizzled receptor activation, establishing that HS is required for Frizzled receptor function. Together, these findings suggest a two-state “catch or present” model for QSulf1 regulation of Wnt signaling in which QSulf1 removes 6-O sulfates from HS chains to promote the formation of low affinity HS–Wnt complexes that can functionally interact with Frizzled receptors to initiate Wnt signal transduction.

ABSTRACT Rationale Congenital diaphragmatic hernia (CDH) is characterized by incomplete closure of the diaphragm and lung hypoplasia. The pathophysiology of lung defects in CDH is poorly understood. Objectives To establish a translational model of human airway epithelium in CDH for pathogenic investigation and therapeutic testing. Methods We developed a robust methodology of epithelial progenitor derivation from tracheal aspirates of newborns. Basal stem cells (BSCs) from CDH patients and preterm and term, non-CDH controls were derived and analyzed by bulk RNA-sequencing, ATAC-sequencing, and air-liquidinterface differentiation. Lung sections from fetal human CDH samples and the nitrofen rat model of CDH were subjected to histological assessment of epithelial defects. Therapeutics to restore epithelial differentiation were evaluated in human epithelial cell culture and the nitrofen rat model of CDH. Measurements and Main Results Transcriptomic and epigenetic profiling of CDH and non-CDH basal stem cells reveals a disease-specific, proinflammatory signature independent of severity or hernia size. In addition, CDH basal stem cells exhibit defective epithelial differentiation in vitro that recapitulates epithelial phenotypes found in fetal human CDH lung samples and fetal tracheas of the nitrofen rat model of CDH. Furthermore, steroid treatment normalizes epithelial differentiation phenotypes of human CDH basal stem cells in vitro and in nitrofen rat tracheas in vivo . Conclusions Our findings have identified an underlying proinflammatory signature and BSC differentiation defects as a potential therapeutic target for airway epithelial defects in CDH.

Abstract Background & Objective Abnormal lung development is the main cause of morbidity and mortality in neonates with congenital diaphragmatic hernia (CDH), a common birth defect (1:2500) of largely unknown pathobiology. Recent studies discovered that inflammatory processes, and specifically NF-κB associated pathways are enriched in human and experimental CDH. However, the molecular signaling of NF-κB in abnormal CDH lung development and its potential as a therapeutic target requires further investigation. Methods & Results Using sections and hypoplastic lung explant cultures from the nitrofen rat model of CDH and human fetal CDH lungs, we demonstrate that NF-κB and its downstream transcriptional targets are hyperactive during abnormal lung formation in CDH. NF-κB activity was especially elevated in the airway epithelium of nitrofen and human CDH lungs at different developmental stages. Fetal rat lung explants had impaired pseudoglandular airway branching after exposure to nitrofen, together with increased phosphorylation and transcriptional activity of NF-κB. Dexamethasone, the broad and clinically applicable anti-inflammatory NF-κB antagonist, rescued lung branching and normalized NF-κB signaling in hypoplastic lung explants. Moreover, specific NF-κB inhibition with curcumenol similarly rescued ex vivo lung hypoplasia and restored NF-κB signaling. Lastly, we showed that prenatal intraperitoneal dexamethasone administration to pregnant rat dams carrying fetuses with hypoplastic lungs, significantly improves lung branching and normalizes NF-κB in vivo . Conclusions: Our results indicate that NF-κB is aberrantly activated in human and nitrofen CDH lungs. Anti-inflammatory treatment with dexamethasone and/ or specific NF-κB inhibition should be investigated further as a therapeutic avenue to target lung hypoplasia in CDH.

Respiratory syncytial virus (RSV) can cause severe disease especially in infants; however, mechanisms of age-associated disease severity remain elusive. Here, employing human bronchial epithelium models generated from tracheal aspirate-derived basal stem cells of neonates and adults, we investigated whether age regulates RSV-epithelium interaction to determine disease severity. We show that following RSV infection, only neonatal epithelium model exhibited cytopathy and mucus hyperplasia, and neonatal epithelium had more robust viral spread and inflammatory responses than adult epithelium. Mechanistically, RSV-infected neonatal ciliated cells displayed age-related impairment of STAT3 activation, rendering susceptibility to apoptosis, which facilitated viral spread. In contrast, SARS-CoV-2 infection of ciliated cells had no effect on STAT3 activation and was not affected by age. Taken together, our findings identify an age-related and RSV-specific interaction with neonatal bronchial epithelium that critically contributes to severity of infection, and STAT3 activation offers a potential strategy to battle severe RSV disease in infants.