Abstract Alveolar rhabdomyosarcoma is a life-threatening myogenic cancer of children and adolescent young adults, driven primarily by the chimeric transcription factor PAX3–FOXO1. The mechanisms by which PAX3–FOXO1 dysregulates chromatin are unknown. We find PAX3–FOXO1 reprograms the cis-regulatory landscape by inducing de novo super enhancers. PAX3–FOXO1 uses super enhancers to set up autoregulatory loops in collaboration with the master transcription factors MYOG, MYOD, and MYCN. This myogenic super enhancer circuitry is consistent across cell lines and primary tumors. Cells harboring the fusion gene are selectively sensitive to small-molecule inhibition of protein targets induced by, or bound to, PAX3–FOXO1-occupied super enhancers. Furthermore, PAX3–FOXO1 recruits and requires the BET bromodomain protein BRD4 to function at super enhancers, resulting in a complete dependence on BRD4 and a significant susceptibility to BRD inhibition. These results yield insights into the epigenetic functions of PAX3–FOXO1 and reveal a specific vulnerability that can be exploited for precision therapy. Significance: PAX3–FOXO1 drives pediatric fusion-positive rhabdomyosarcoma, and its chromatin-level functions are critical to understanding its oncogenic activity. We find that PAX3–FOXO1 establishes a myoblastic super enhancer landscape and creates a profound subtype-unique dependence on BET bromodomains, the inhibition of which ablates PAX3–FOXO1 function, providing a mechanistic rationale for exploring BET inhibitors for patients bearing PAX-fusion rhabdomyosarcoma. Cancer Discov; 7(8); 884–99. ©2017 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 783

Abstract The small molecule inhibitor of ataxia telangiectasia and Rad3-related protein (ATR), elimusertib, is currently being tested clinically in various cancer entities in adults and children. Its preclinical anti-tumor activity in pediatric malignancies, however, is largely unknown. We here assessed the preclinical activity of elimusertib in >40 cell lines and >30 patient-derived xenograft (PDX) models derived from common pediatric solid tumor entities. Detailed in vitro and in vivo molecular characterization of the treated models enabled the evaluation of response biomarkers. Pronounced objective response rates were observed for elimusertib monotherapy in PDX, when treated with a regimen currently used in clinical trials. Strikingly, elimusertib outperformed standard of care chemotherapies, particularly in alveolar rhabdomysarcoma PDX. Thus, elimusertib has strong preclinical anti-tumor activity in pediatric solid tumor models, which may translate to clinically meaningful responses in patients. Statement of translational relevance Elimusertib is a small molecule inhibitor of ATR. ATR inhibitors have shown promising results as anticancer agents in adult cancers, but there is limited information on their effectiveness in pediatric solid tumors. Using a cohort of 32 patient-derived xenografts from pediatric solid tumors, we here evaluated the therapeutic potential of elimusertib in vivo . Elimusertib reduced tumor volume growth in all samples. Elimusertib had very limited toxicity and was potent even in tumors with preexisting chemoresistance. Our preclinical data indicates that elimusertib is a safe and potent therapeutic option for pediatric solid tumors. This data may serve as a rationale for the development of pediatric clinical trials for ATR inhibitors.

ABSTRACT Rhabdomyosarcoma (RMS) is an aggressive human pediatric cancer. Despite robust expression of myogenic regulatory factors, RMS cells are blocked in a proliferative state and do not terminally differentiate. The extent to which the skeletal muscle lineage is represented in RMS tumors and the mechanisms leading to developmental arrest remain elusive. Here, we combined single-cell RNA sequencing (scRNAseq), mass cytometry (CyTOF) and high-content imaging to resolve RMS heterogeneity. ScRNAseq and CyTOF analysis of a total of 17 patient-derived primary cultures and three cell lines uncovered plastic myogenic subpopulations that delineate a branched trajectory. The less aggressive embryonal RMS (eRMS) harbor primarily muscle stem cell (MuSC)-like cells and exhibit sparse commitment to differentiation. The more aggressive alveolar RMS (aRMS) comprise primarily actively cycling committed progenitors with a paucity of differentiated cells. The oncogenic fusion protein PAX3:FOXO1 sustains aRMS cells in the cycling trajectory loop, which we show can re-wired towards differentiation upon its downregulation or by dual pharmacological RAF and MEK inhibition. Our findings provide insights into the developmental states and trajectories underlying RMS progression and identify the RAS pathway as a promising target of differentiation therapy for human aRMS. STATEMENT OF SIGNIFICANCE We present the first comprehensive single-cell transcriptomic and proteomic atlas of pediatric rhabdomyosarcoma (RMS), in which we identify impaired myogenic trajectories with prognostic value. We demonstrate that RAS pathway inhibitors disrupt the oncogenic trajectory and induce terminal differentiation, revealing novel therapeutic targets for the aggressive alveolar RMS subtype.

Abstract Rhabdomyosarcoma (RMS) is a pediatric tumor that resembles undifferentiated muscle cells; yet the extent to which cell state heterogeneity is shared with human development has not been described. Using single-cell/nucleus RNA sequencing from patient tumors, patient-derived xenografts, primary in vitro cultures, and cell lines, we identify four dominant muscle-lineage cell states: progenitor, proliferative, differentiated, and ground cells. We stratify these RMS cells/nuclei along the continuum of human muscle development and show that they share expression patterns with fetal/embryonal myogenic precursors rather than postnatal satellite cells. Fusion-negative RMS (FN-RMS) have a discrete stem cell hierarchy that recapitulates fetal muscle development and contain therapy-resistant FN-RMS progenitors that share transcriptomic similarity with bipotent skeletal mesenchymal cells. Fusion-positive RMS have tumor-acquired cells states, including a neuronal cell state, that are not found in myogenic development. This work identifies previously underappreciated cell state heterogeneity including unique treatment-resistant and tumor-acquired cell states that differ across RMS subtypes.

Core regularity transcription factors (CR TFs) define cell identity and lineage through an exquisitely precise and logical order during embryogenesis and development. These CR TFs regulate one another in three-dimensional space via distal enhancers that serve as logic gates embedded in their TF recognition sequences. Aberrant chromatin organization resulting in miswired circuitry of enhancer logic is a newly recognized feature in many cancers. Here, we report that PAX3-FOXO1 expression is driven by a translocated FOXO1 distal super enhancer (SE). Using 4C-seq, a technique detecting all genomic regions that interact with the translocated FOXO1 SE, we demonstrate its physical interaction with the PAX3 promotor only in the presence of the oncogenic translocation. Furthermore, RNA-seq and ChIP-seq in tumors bearing rare PAX translocations implicate enhancer miswiring is a pervasive feature across all FP-RMS tumors. HiChIP of enhancer mark H3K27ac showed extended connectivity between the distal FOXO1 SE and additional intra-domain enhancers and the PAX3 promoter. We show by CRISPR-paired-ChIP-Rx that PAX3-FOXO1 transcription is diminished when this network of enhancers is selectively ablated. Therefore, our data reveal a mechanism of a translocated hijacked enhancer which disrupts the normal CR TF logic during skeletal muscle development (PAX3 to MYOD to MYOG), replacing it with an infinite loop logic that locks rhabdomyosarcoma cells in an undifferentiated proliferating stage.

SUMMARY Rhabdomyosarcoma (RMS) is a pediatric tumor that resembles undifferentiated muscle cells; yet the extent to which cell state heterogeneity and molecular features are shared with human development have not been fully ascribed. Here, we report a single-cell/nucleus RNA sequencing atlas derived from 72 datasets that includes patient tumors, patient-derived xenografts, primary in vitro cultures, and established cell lines. We report four dominant muscle-lineage cell states in RMS: progenitors, proliferative, differentiated, and ground cells. We stratify these RMS cells along the continuum of human muscle development and show that RMS cells share expression patterns with fetal/embryonal myogenic precursors rather than postnatal satellite cells. Indeed, fusion-negative RMS (FN-RMS) have a discrete stem cell hierarchy that faithfully recapitulates fetal muscle development. We also identify therapy-resistant FN-RMS progenitor cells that share transcriptomic similarity with bipotent skeletal mesenchymal cells, while a subset of fusion-positive (FP) RMS have tumor-acquired cells states, including a neuronal cell state, that are not found in development. Chemotherapy induced upregulation of progenitor signatures in FN-RMS while the neuronal gene programs were retained after therapy in FP-RMS. Taken together, this work identifies new cell state heterogeneity including unique treatment-resistant and tumor-acquired cell states that differ across RMS subtypes.

Abstract Introduction: Ewing sarcoma is an aggressive type of pediatric bone cancer, characterized by a fusion transcription factor (EWSR1-FLI1 in 85% of cases1,2). Recurrent secondary mutations are limited to alterations in TP53, CDKN2A and most frequently STAG2 (15-22%3-6). STAG2-loss-of-function (LOF) mutations correlate with poor prognosis, metastasis and relapse3,5,6, and are shown to induce a metastatic phenotype in preclinical studies7,8. Despite intensive multimodal treatment (surgery, radiation and chemotherapy), the estimated 5-year survival is a mere 65-75% for patients with localized disease, and below 30% for those presenting with metastasis or relapse9. Targeted treatment is currently not available. Our current work aims at identifying synthetic lethal (SL) interactions with STAG2-LOF mutations in the context of Ewing sarcoma, which could represent potential avenues for targeted therapy. Methods: In order to identify STAG2-SL interactions, we have performed genome-wide and subsequent targeted CRISPR knockout (KO) screening in Ewing sarcoma cell lines and their isogenic CRISPR-engineered STAG2-KO clones. To capture Ewing sarcoma inter- and intra-tumoral heterogeneity, we engineered additional bulk STAG2-KO populations across a wide range of cell lines and primary samples, using a lentiviral approach. These isogenic (STAG2 +/-) models are used for high throughput drug screening, validation of screening results and investigation of underlying SL mechanisms. Results: The quality of our genetic screening is validated by the recurrent emergence of (untargetable) paralog STAG1 as the top STAG2-SL hit. Additional preliminary results include a targetable candidate that emerged from both CRISPR- and drug-based screens in most of our tested models. Validation experiments across a broader panel of isogenic cell lines and primary models are currently ongoing. Conclusion: In this work, we employ genetic and drug-based screening approaches across a panel of isogenic (STAG2+/-) Ewing sarcoma cell lines, aiming to identify STAG2-SL interactions. These approaches have yielded potential hits that are currently being investigated across a broader panel of Ewing cell lines and primary models. Ultimately, this work aims to identify novel targeted therapeutic strategies for this aggressive subtype of Ewing sarcoma. References: 1. Grünewald, T. et al. Nat. Rev. Dis. Prim. (2018). 2. Delattre, O. et al. Nature (1992). 3. Crompton, B. D. et al. Cancer Discov. (2014). 4. Brohl, A. S. et al. PLoS Genet. (2014). 5. Tirode, F. et al. Cancer Discov. (2014). 6. Shulman, D. S. et al. Br. J. Cancer (2022). 7. Surdez, D. et al. Cancer Cell (2021). 8. Adane, B. et al. Cancer Cell (2021). 9. Gaspar, N. et al. J. Clin. Oncol. (2015). Citation Format: Lieke Mous, Michelle Hofer, Dorita Zabėlė, Ingrid Bechtold, Sakina Zaidi, Camille Fouassier, Pierre Gestraud, Aurélien Boré, Raphaël Margueron, Marco Wachtel, Beat Schäfer, Olivier Delattre, Didier Surdez. Synthetic lethality in the context of STAG2-mutant Ewing sarcoma [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Expanding and Translating Cancer Synthetic Vulnerabilities; 2024 Jun 10-13; Montreal, Quebec, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(6 Suppl):Abstract nr A009.