Thermogenesis in brown adipose tissue (BAT) is fundamental to energy balance and is also relevant for humans. Bone morphogenetic proteins (BMPs) regulate adipogenesis, and, here, we describe a role for BMP8B in the direct regulation of thermogenesis. BMP8B is induced by nutritional and thermogenic factors in mature BAT, increasing the response to noradrenaline through enhanced p38MAPK/CREB signaling and increased lipase activity. Bmp8b−/− mice exhibit impaired thermogenesis and reduced metabolic rate, causing weight gain despite hypophagia. BMP8B is also expressed in the hypothalamus, and Bmp8b−/− mice display altered neuropeptide levels and reduced phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK), indicating an anorexigenic state. Central BMP8B treatment increased sympathetic activation of BAT, dependent on the status of AMPK in key hypothalamic nuclei. Our results indicate that BMP8B is a thermogenic protein that regulates energy balance in partnership with hypothalamic AMPK. BMP8B may offer a mechanism to specifically increase energy dissipation by BAT.

Sirtuins are homologues of the yeast transcriptional repressor Sir2p and are conserved from bacteria to humans. We report that human SIRT4 is localized to the mitochondria. SIRT4 is a matrix protein and becomes cleaved at amino acid 28 after import into mitochondria. Mass spectrometry analysis of proteins that coimmunoprecipitate with SIRT4 identified insulindegrading enzyme and the ADP/ATP carrier proteins, ANT2 and ANT3. SIRT4 exhibits no histone deacetylase activity but functions as an efficient ADP-ribosyltransferase on histones and bovine serum albumin. SIRT4 is expressed in islets of Langerhans and colocalizes with insulin-expressing β cells. Depletion of SIRT4 from insulin-producing INS-1E cells results in increased insulin secretion in response to glucose. These observations define a new role for mitochondrial SIRT4 in the regulation of insulin secretion. Sirtuins are homologues of the yeast transcriptional repressor Sir2p and are conserved from bacteria to humans. We report that human SIRT4 is localized to the mitochondria. SIRT4 is a matrix protein and becomes cleaved at amino acid 28 after import into mitochondria. Mass spectrometry analysis of proteins that coimmunoprecipitate with SIRT4 identified insulindegrading enzyme and the ADP/ATP carrier proteins, ANT2 and ANT3. SIRT4 exhibits no histone deacetylase activity but functions as an efficient ADP-ribosyltransferase on histones and bovine serum albumin. SIRT4 is expressed in islets of Langerhans and colocalizes with insulin-expressing β cells. Depletion of SIRT4 from insulin-producing INS-1E cells results in increased insulin secretion in response to glucose. These observations define a new role for mitochondrial SIRT4 in the regulation of insulin secretion. Histone deacetylases are enzymes that catalyze the removal of acetyl groups from the ϵ-amino group of lysine residues and are separated into three classes. Sirtuins, the class III histone deacetylases, are homologous to the yeast transcriptional repressor, Sir2p, and are NAD+-dependent enzymes (1North B.J. Verdin E. Genome Biol. 2004; 5: 224Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 2Denu J.M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005; 9: 431-440Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar, 3Guarente L. Genes Dev. 2000; 14: 1021-1026Crossref PubMed Google Scholar). Seven sirtuins have been identified in the human genome (4Frye R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 260: 273-279Crossref PubMed Scopus (665) Google Scholar, 5Frye R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 273: 793-798Crossref PubMed Scopus (1153) Google Scholar). They share a conserved Sir2 catalytic core domain and exhibit variable amino- and carboxyl-terminal extensions that contribute to their unique subcellular localization and may also regulate their catalytic activity. The subcellular distribution, substrate specificity, and cellular functions of sirtuins are quite diverse (reviewed in Refs. 1North B.J. Verdin E. Genome Biol. 2004; 5: 224Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 2Denu J.M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005; 9: 431-440Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar, 3Guarente L. Genes Dev. 2000; 14: 1021-1026Crossref PubMed Google Scholar). SIRT1 is found in the nucleus, where it functions as a transcriptional repressor via histone deacetylation. SIRT1 can also regulate transcription by modifying the acetylation levels of transcription factors, such as MyoD, FOXO, p53, and NF-κB (6Fulco M. Schiltz R.L. Iezzi S. King M.T. Zhao P. Kashiwaya Y. Hoffman E. Veech R.L. Sartorelli V. Mol. Cell. 2003; 12: 51-62Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (505) Google Scholar, 7Brunet A. Sweeney L.B. Sturgill J.F. Chua K.F. Greer P.L. Lin Y. Tran H. Ross S.E. Mostoslavsky R. Cohen H.Y. Hu L.S. Cheng H.L. Jedrychowski M.P. Gygi S.P. Sinclair D.A. Alt F.W. Greenberg M.E. Science. 2004; 303: 2011-2015Crossref PubMed Scopus (2634) Google Scholar, 8Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2288) Google Scholar, 9Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1884) Google Scholar, 10Yeung F. Hoberg J.E. Ramsey C.S. Keller M.D. Jones D.R. Frye R.A. Mayo M.W. EMBO J. 2004; 23: 2369-2380Crossref PubMed Scopus (2186) Google Scholar, 11Langley E. Pearson M. Faretta M. Bauer U.M. Frye R.A. Minucci S. Pelicci P.G. Kouzarides T. EMBO J. 2002; 21: 2383-2396Crossref PubMed Scopus (753) Google Scholar, 12Motta M.C. Divecha N. Lemieux M. Kamel C. Chen D. Gu W. Bultsma Y. McBurney M. Guarente L. Cell. 2004; 116: 551-563Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1192) Google Scholar). The SIRT2 protein is found in the cytoplasm, where it associates with microtubules and deacetylates lysine 40 of α-tubulin (13North B.J. Marshall B.L. Borra M.T. Denu J.M. Verdin E. Mol. Cell. 2003; 11: 437-444Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1232) Google Scholar). The SIRT3 protein is localized in the mitochondrial matrix (14Schwer B. North B.J. Frye R.A. Ott M. Verdin E. J. Cell Biol. 2002; 158: 647-657Crossref PubMed Scopus (456) Google Scholar, 15Onyango P. Celic I. McCaffery J.M. Boeke J.D. Feinberg A.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 13653-13658Crossref PubMed Scopus (435) Google Scholar), where it is proteolytically processed at its NH2 terminus, yielding a mature protein that has protein deacetylase activity (14Schwer B. North B.J. Frye R.A. Ott M. Verdin E. J. Cell Biol. 2002; 158: 647-657Crossref PubMed Scopus (456) Google Scholar). These observations indicate that the targets of sirtuins are not restricted to histone proteins but extend to acetylated proteins in other subcellular compartments. Sirtuins also differ in their substrate specificities. For instance, SIRT1, -2, and -3 have robust activity on chemically acetylated histone H4 peptides, whereas SIRT5 has weak but detectable activity, and SIRT4, -6, and -7 have no detectable activity on the same substrate (13North B.J. Marshall B.L. Borra M.T. Denu J.M. Verdin E. Mol. Cell. 2003; 11: 437-444Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1232) Google Scholar). Interestingly, a sirtuin from Archaeoglobus fulgidus, Sir2-Af1, which has close homology with SIRT5, also has weak activity on a histone peptide but significantly stronger activity on an acetylated bovine serum albumin substrate (16Min J. Landry J. Sternglanz R. Xu R.M. Cell. 2001; 105: 269-279Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar, 17Avalos J.L. Celic I. Muhammad S. Cosgrove M.S. Boeke J.D. Wolberger C. Mol. Cell. 2002; 10: 523-535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (202) Google Scholar). Similarly, both SIRT1 and SIRT2 can deacetylate p53; however, only SIRT2 deacetylates lysine 40 of α-tubulin (13North B.J. Marshall B.L. Borra M.T. Denu J.M. Verdin E. Mol. Cell. 2003; 11: 437-444Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1232) Google Scholar, 17Avalos J.L. Celic I. Muhammad S. Cosgrove M.S. Boeke J.D. Wolberger C. Mol. Cell. 2002; 10: 523-535Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (202) Google Scholar). Recently, SIRT6 was demonstrated to be a nuclear ADP-ribosyltransferase (18Liszt G. Ford E. Kurtev M. Guarente L. J. Biol. Chem. 2005; 280: 21313-21320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (452) Google Scholar), whereas a T. brucei SIR2 homologue exhibited both histone NAD-dependent ADP-ribosyltransferase and deacetylase activities (19Garcia-Salcedo J.A. Gijon P. Nolan D.P. Tebabi P. Pays E. EMBO J. 2003; 22: 5851-5862Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar). These observations indicate that sirtuins can function either as NAD-dependent protein deacetylases or as ribosyltransferases. The substrate specificities of SIRT3 to -7 are unknown. Determining the localization patterns of these proteins is the first step in elucidating the physiologically relevant targets for deacetylation by each of these enzymes. Here, we report that SIRT4 is targeted to the mitochondrial matrix, where it interacts with insulin-degrading enzyme and the ADP/ATP carrier protein. Depletion of SIRT4 from insulin producing INS-1E cells results in increase in secretion of insulin from these cells in response to glucose, suggesting that SIRT4 negatively regulates insulin secretion in these cells. Tissue Culture—HEK293, HEK293T and HeLa cells were grown in Dulbeccoʼns modified Eagleʼns medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gemini Bio-products, Woodland, CA) in the presence of penicillin, streptomycin, and 2 mm l-glutamine (Invitrogen). The clonal β cell line INS-1E (20Merglen A. Theander S. Rubi B. Chaffard G. Wollheim C.B. Maechler P. Endocrinology. 2004; 145: 667-678Crossref PubMed Scopus (474) Google Scholar), derived from parental INS-1 cells (21Asfari M. Janjic D. Meda P. Li G. Halban P.A. Wollheim C.B. Endocrinology. 1992; 130: 167-178Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar), was grown in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium supplemented with 5% fetal calf serum, 10 mm Hepes, 2 mm glutamine, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 1 mm sodium pyruvate, and 50 μm 2-mercaptoethanol. Adherent cultures of INS-1E cells were transfected with control siRNA 3The abbreviations used are: siRNA, small interfering RNA; IDE, insulin-degrading enzyme; BSA, bovine serum albumin; PBS, phosphate-buffered saline; HM, heavy membrane; LM, light membrane; MOPS, 4-morpholinepropanesulfonic acid; MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight. or siRNA against SIRT4 (synthesized by Dharmacon Inc., Chicago, IL) and further cultured in complete RPMI 1640 medium for 3 days before experiments. Plasmids and Mutagenesis—The human SIRT4 gene was cloned in a derivative of pcDNA3.1(+) (FLAG vector) to generate the construct encoding SIRT4-FLAG, as described (13North B.J. Marshall B.L. Borra M.T. Denu J.M. Verdin E. Mol. Cell. 2003; 11: 437-444Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1232) Google Scholar). Deletion mutants of SIRT4 were constructed by using oligo-directed, PCR-based mutagenesis. The QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) was used for site-directed mutagenesis. Antibodies—The following antibodies were obtained commercially: anti-Hsp60 (clone 4B9/89; Affinity Bioreagents, Golden, CO), anti-Hsp70 (clone JG1; Affinity Bioreagents), anti-Hsp90 (SPS-771; Stressgen Biotechnologies, San Diego, CA), anti-cytochrome c oxidase subunit IV (clone 20E8-C12; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), anti-cytochrome c (clone 7H8.2C12; Pharmingen, San Diego, CA), anti-FLAG M2 (Sigma), anti-insulin-degrading enzyme (clone BC-2; Covance, Berkeley, CA), Cy2-conjugated anti-mouse secondary antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), and rabbit polyclonal anti-FLAG (Sigma). SIRT4 antiserum was raised in rabbits (Sigma-Genosys) against a COOH-terminal peptide corresponding to the last 15 amino acids of SIRT4 (NH2-LNSRCGELLPLIDPC-COOH). ANT2-specific antiserum was kindly provided by Dr. Douglas C. Wallace (University of California, Irvine) and immune affinity-purified as described (22Graham B.H. Waymire K.G. Cottrell B. Trounce I.A. MacGregor G.R. Wallace D.C. Nat. Genet. 1997; 16: 226-234Crossref PubMed Scopus (434) Google Scholar). Immunofluorescence and Confocal Microscopy—HeLa cells grown on glass coverslips were transfected with Lipofectamine (Invitrogen). After 24 h of transfection, the cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with Dulbeccoʼns modified Eagleʼns medium containing 40 nm MitoTracker Red (CMXRos; Molecular Probes) for 45 min at 37 °C, washed in PBS, and incubated with Dulbeccoʼns modified Eagleʼns medium for 1 h. The cells were then washed, fixed in 3.7% paraformaldehyde for 10 min at 37 °C, permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 10 min, and blocked with 1% bovine serum albumin for 10 min. Immunostaining was then done with monoclonal anti-FLAG M2 antibody (1:500) for 1 h followed by incubation with a Cy2-conjugated anti-mouse secondary antibody (1:500) for 30 min. The cells were washed twice with PBS containing 0.1% Tween 20 and once briefly with water. The coverslips were mounted on glass slides and analyzed by confocal laser-scanning microscopy with an Olympus BX60 microscope equipped with a Radiance 2000 confocal setup (Bio-Rad). Differential Centrifugation—HEK293T cells were harvested by centrifugation and resuspended in ice-cold buffer A (250 mm sucrose, 10 mm KCl, 1.5 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm dithiothreitol, 20 mm HEPES-KOH, pH 7.5) containing protease inhibitor mixture (Complete; Roche Applied Science). Cells were homogenized using Dounce homogenization (Wheaton, Millville, NJ). After removal of nuclei and unbroken cells by centrifugation at 770 × g for 10 min, the heavy membrane (HM) fraction was prepared by centrifugation at 5,500 × g for 10 min. The resulting supernatant was centrifuged at 100,000 × g for 1 h to separate the light membrane (LM) fraction (pellet) from the cytosolic proteins (S100). The HM and the LM fractions were solubilized in lysis buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mm EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 150 mm NaCl), and the protein content was determined with Bio-Rad DC protein assay reagent. Equal amounts of protein from each fraction were subjected to SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting. Transient Transfections and Immunoprecipitations—HEK293T cells were transfected by the calcium phosphate DNA precipitation method and harvested 48 h after transfection. Mitochondria were isolated by differential centrifugation as described above and lysed in lysis buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mm EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 150 mm NaCl) in the presence of a protease inhibitor mixture. SIRT4-FLAG was immunoprecipitated with anti-FLAG M2-agarose affinity gel (Sigma) for 2 h at 4 °C from total cell lysate. Immunoprecipitated material was washed three times for 15 min each with lysis buffer and dissolved in SDS-PAGE sample buffer. Protease Accessibility Assays—Mitochondria from HEK293T cells were resuspended in SM buffer (250 mm sucrose, 10 mm MOPS-KOH, pH 7.2) and aliquoted in three tubes. Mitochondria were pelleted by centrifugation and resuspended in SM buffer, hypotonic buffer (10 mm MOPS-KOH, pH 7.2), or SM buffer containing 1% (w/v) Triton X-100. The mitochondria were incubated on ice for 5 min and digested with Proteinase K (150 μg/ml) on ice for 15 min. Proteolysis was stopped with 2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, and proteins were precipitated in 15% trichloroacetic acid, collected by centrifugation, washed with acetone, recentrifuged, and analyzed by immunoblotting. Alkaline Extraction Experiments—Mitochondria were isolated from HEK293T cells expressing SIRT4-FLAG and resuspended in freshly prepared ice-cold 0.1 m sodium carbonate (pH 11.5) for 30 min at 4 °C. Mitochondria were centrifuged at 100,000 × g for 30 min at 4 °C followed by solubilization in SDS sample buffer. Supernatant proteins were concentrated by trichloroacetate precipitation, solubilized in SDS sample buffer, and analyzed by immunoblotting. Mitochondrial Sonication—Mitochondria were isolated from cells expressing SIRT4-FLAG, resuspended in sonication buffer (20 mm Tris, pH 7.5, 100 mm NaCl), and sonicated with a microtip sonicator (Cole-Parmer Instruments, model CP130, three times for 6 s, 40% duty cycle, microtip output setting 6). The sonicated sample was centrifuged at 100,000 × g for 30 min at 4 °C to separate the membranes (pellet) from the soluble proteins. In Vitro ADP-ribosylation—HEK293 cells overexpressing SIRT4-FLAG were solubilized in lysis buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mm EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 150 mm NaCl) in the presence of a protease inhibitor mixture, and SIRT4-FLAG was immunoprecipitated with anti-FLAG M2-agarose affinity gel (Sigma) for 2 h at 4 °C from total cell lysate. Immunoprecipitated material was washed three times for 15 min each with lysis buffer containing 300 mm NaCl and followed by SIRT4-FLAG elution with 100 μg/ml FLAG peptide (Sigma). The ADP-ribosylation reaction contained 10 μg of BSA (Sigma) or total histone proteins (Roche Applied Science) and the following buffer: 10 mm dithiothreitol, 2 mm EDTA, and 50 mm Tris-HCl (pH 8.0). The reaction was initiated by adding 2.5 μCi of [32P]NAD and SIRT4 (0.5 μg/reaction), and the reaction was allowed to proceed for 1 h at 37 °C. Free radioactivity was removed from the samples using spin column (Amersham Biosciences). Samples were mixed with SDS-PAGE loading buffer and separated on 12% SDS-polyacrylamide gels after boiling for 5 min. The gels were dried, and autoradiography was performed. Generation of Stable Cell Line Overexpressing SIRT4-FLAG and SIRT5-FLAG—SIRT4 (or SIRT5)-FLAG-pcDNA3.1+ vector or empty-pcDNA3.1+ control vector was linearized with the enzyme SspI, gel-purified, and transfected into HEK293 cells. After 48 h of transfection, the cells were selected in medium containing 700 μg/ml G418. SIRT4 Immunoprecipitation and Peptide Mass Fingerprinting—Cells expressing SIRT4-FLAG were harvested and solubilized in lysis buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mm EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 150 mm NaCl) in the presence of a protease inhibitor mixture, and SIRT4-FLAG was immunoprecipitated with anti-FLAG M2-agarose affinity gel (Sigma) overnight at 4 °C from total cell lysate. Immunoprecipitated material was washed three times for 15 min each with lysis buffer containing 300 mm NaCl and resuspended in SDS-sample buffer. The samples were subjected to SDS-PAGE followed by Coomassie Blue staining. Bands corresponding to proteins specifically interacting with SIRT4 were excised and prepared for mass spectrometry. Gel slices were destained in 25 mm ammonium bicarbonate, 50% acetonitrile. Gel pieces were treated with 100% acetonitrile until shrinking of the gel pieces was noted. Acetonitrile was removed, and the gel pieces were dried in a vacuum centrifuge. Samples were reduced by treatment with 10 mm dithiothreitol solution for 45 min at 56 °C. The supernatant was removed, and the samples were alkylated in 55 mm iodoacetamide solution for 30 min in darkness at room temperature. After washing in 25 mm ammonium bicarbonate for 15 min, the gel pieces were treated with 100% acetonitrile for 5 min and completely dried in a vacuum centrifuge. 25 μl of trypsin (12.5 ng/ml) were added to the dried gel pieces, followed by incubation on ice for 30 min. 25 mm ammonium bicarbonate was added to cover the gel pieces. After in-gel digestion for 16 h at 37 °C, the supernatant was transferred to a fresh tube, and peptides were extracted twice by vortexing the gel pieces for 20 min in 50% acetonitrile, 5% trifluoroacetic acid. Aqueous and organic peptide extracts were combined and concentrated under vacuum. Peptide mass fingerprints were obtained by mixing 0.5 μl of each in-gel digest peptide extract with 0.5 μl of matrix solution (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (5 mg/ml) in 50% acetonitrile, 50% water, 0.1% trifluoroacetic acid) directly on a stainless steel target. After co-crystallization of the peptide mixture with the matrix, peptide mass maps were obtained using a Voyager DE STR MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems). In the MALDI-TOF process, peptides were ionized following a matrix-analyte crystal irradiation with a pulsed nitrogen laser (337 nm) that struck the sample at a frequency of 20 Hz. A voltage of 25 kV accelerated the peptide ions out of the ion source into the flight tube after a 125-ns delay. Monoprotonated peptide ions were temporally separated according to their mass/charge ratios as they drifted down the flight tube through the reflector mass analyzer, eventually striking the detector. Individual peptide masses were determined by measuring the time it took each ion to travel the distance from its origin to the detector. Delayed extraction of peptide ions from the ion source in combination with the kinetic energy-focusing properties of the reflector (also called the ion mirror) provided mass resolution sufficient for determining the monoisotopic mass of each peptide. Close proximity external calibration enabled peptide masses to be measured within +50–100 ppm of their theoretical values. Protein identification was accomplished by comparing the experimentally generated set of peptide masses with theoretically predicted sets of tryptic peptides derived from each protein in the Swiss-Prot data base (available on the World Wide Web) by a process of “in silico digestion.” Data base searches were performed using the Aldente Peptide Mass Fingerprinting Tool available to the public on the World Wide Web. Immunoprecipitations and Western Blotting—HEK293 cells stably expressing SIRT4-FLAG, SIRT5-FLAG, or a FLAG-control vector were plated in 100-mm dishes. Confluent cells were rinsed off with ice-cold PBS, washed twice in PBS, and lysed in lysis buffer (1% Nonidet P-40, 1 mm EDTA, 150 mm NaCl, 50 mm Tris, pH 7.4) containing protease inhibitors (Roche Applied Science EDTA-free mixture) for 1 h on ice. Lysates were cleared (16,100 × g, 15 min, 4 °C) and immunoprecipitated with anti-FLAG M2-agarose (Sigma) for 3 h at 4 °C. Immunoprecipitates were washed five times with lysis buffer and analyzed by Western blotting. Immunohistochemistry—Detection of SIRT4 protein in human tissues was performed on normal human tissue samples using the immunoperoxidase technique and the ABC Vectastain Elite kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). An anti-human SIRT4 antibody raised against a synthetic peptide composed of amino acids 240–254 (DKVDFVHKRVKEADS) of human SIRT4 was used (Orbigen, San Diego, CA). Five-μm-thick sections of formalin-fixed paraffin-embedded tissue were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded alcohols. After blocking of endogenous peroxidase activity with 1.5% hydrogen peroxide in methanol for 30 min, the sections were incubated with 1% normal goat serum in PBS for 60 min. Rabbit anti-SIRT4 antibody (1:150 dilution) was incubated overnight at 4 °C, followed by biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody and the avidin-biotin-peroxidase complex. Washes were performed three times with PBS after each incubation step. Peroxidase activity was developed by a solution of 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Vel, Leuven, Belgium) dissolved in PBS and 0.03% H2O2. The 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride solution was filtered and applied to the sections for 3 min. Carazziʼns hematoxylin was used to counterstain the slides followed by dehydration and mounting. Control experiments were performed with omission of the first antibody in the immunoperoxidase assay. Detection of insulin expression by the β cells of the pancreatic islets of Langerhans was performed on serial sections of normal human pancreas using the ABC Vectastain Elite kit and a mouse monoclonal anti-insulin antibody at a dilution of 1:500 (clone 2D11-H5; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Other controls included normal rabbit IgGs (purchased from Serotec, purified polyclonal rabbit IgG from normal rabbit serum) and rabbit anti-bone sialoprotein antibody (LF-83, provided by L. W. Fisher, National Institutes of Health) on normal human pancreas or on a case of poorly differentiated human prostate cancer. Photomicrographs of the slides were taken with a Zeiss microscope equipped with a Leica camera. siRNA Preparation—siRNAs corresponding to the SIRT4 gene were designed as recommended and were chemically synthesized by Dharmacon RNA Technologies (Dharmacon Inc., Chicago, IL). Transfections—Transfection of control siRNA, siRNA against SIRT4 for down-regulation, pFLAG-control, and pFLAG-SIRT4 cDNA for up-regulation were all performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in 24-well plates according to the manufacturerʼns specifications. Briefly, 2 × 105 INS-1E cells were seeded per well into 24-well plates, reaching 50–60% confluence the day of transfection. siRNAs mixtures were incubated for 30 min with Lipofectamine 2000 diluted in serum-free RPMI 1640 before transfer to cells. Next, cells were treated with the respective mixtures for 6 h in the incubator before medium replacement. Transfected cells were kept in culture for 3 days before proceeding to experiments. Different siRNA-SIRT4 concentrations (250, 500, and 1000 nm) were tested in INS-1E cells, and efficiency was assessed by quantitative real time PCR. Overexpression was carried out using 0.14 μg of SIRT4 plasmid DNA/well. Quantitative Real Time PCR—INS-1E cells cultured in 24-well plates were transfected with siRNA-SIRT4. Three days after transfection, total RNA was extracted using the RNeasy Mini Kit (Qiagen), and 2 μg was converted into cDNA. Primers for rat SIRT4 and rat cyclophilin were designed using the Primer Express Software (Applera Europe). Real time PCR was performed using an ABI 7000 sequence detection system (Applera Europe), and PCR products were quantified fluorometrically using the SYBR Green core reagent kit. The values obtained were normalized to the values of rat cyclophilin mRNA. Rat SIRT4 primers were as follows: 5′-CCA TCC AGC ACA TTG ATT TCA-3′;5′-GGC CAG CCC ACA AAG TTT C-3′. Rat cyclophilin primers were as follows: 5′-TCA CCA TCT CCG ACT GTG GA-3′;5′-AAA TGC CCG CAA GTC AAA GA-3′. Immunoblotting—Ten μg of protein of INS-1E cells was analyzed per lane on 12% SDS-polyacrylamide gels. Proteins were transferred onto nitrocellulose membrane and subsequently incubated overnight at 4 °C in the presence of goat anti-SIRT4 polyclonal antibody (1:500) raised against human SIRT4 (Abcam, Cambridge, MA). The membrane was then incubated for 2 h with donkey anti-goat IgG antibody (1:5000) conjugated to horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), and the SIRT4 protein was revealed by chemiluminescence (Pierce). Insulin Secretion Assay—INS-1E cells cultured in 24-well plates were transfected with 250 nm control siRNA or siRNA-SIRT4 and assayed 3 days after for insulin secretion as previously described (20Merglen A. Theander S. Rubi B. Chaffard G. Wollheim C.B. Maechler P. Endocrinology. 2004; 145: 667-678Crossref PubMed Scopus (474) Google Scholar). Prior to the experiments, cells were maintained for 2 h in glucose- and glutamine-free culture medium. The cells were then washed and preincubated further in glucose-free KRBH, supplemented with 0.1% bovine serum albumin as carrier, before the incubation period (30 min at 37 °C) at basal (2.5 mm) and stimulatory (7.5 and 15 mm) glucose concentrations, with the mitochondrial substrate methyl-succinate (5 mm) as well as in the presence 30 mm KCl used as a calcium-raising agent. At the end of the incubation period, supernatants were collected and quantified for absolute insulin secretion, and insulin was extracted from cells using acid-EtOH in order to measure total insulin content. Insulin levels were determined by radioimmunoassay using rat insulin as standard, and secretion was expressed according to cellular protein concentrations. Cellular ATP Monitoring—ATP levels were monitored in INS-1E cells expressing the ATP-sensitive bioluminescent probe luciferase following infection with the specific viral construct. Briefly, cells were transduced with AdCA-cLuc (driving the expression of cytosolic luciferase) and used 20 h later for experiments. Cells were washed with 1 ml of KRBH and incubated for 30 min at 37 °C at 2.5 mm glucose. Then KRBH containing 100 μm luciferin was added, and the luminescence was monitored in the plate reader luminometer (Fluostar Optima) (20Merglen A. Theander S. Rubi B. Chaffard G. Wollheim C.B. Maechler P. Endocrinology. 2004; 145: 667-678Crossref PubMed Scopus (474) Google Scholar). Statistical Analysis—Where applicable, the results were expressed as means ± S.D. Differences between groups were analyzed by Studentʼns t test for unpaired data, and significance was assessed by a p value of less than 0.05. SIRT4 Is a Mitochondrial Protein—To study the subcellular localization of human SIRT4, HeLa cells were transiently transfected with a plasmid encoding SIRT4-FLAG. Immunofluorescence analysis of the transfected cells by confocal microscopy showed that SIRT4-FLAG was exclusively localized in discrete rod-shaped structures in the cytosol that were reminiscent of mitochondria (Fig. 1A). The colocalization of this fluorescence with MitoTracker Red, a dye that preferentially accumulates in mitochondria, confirmed the mitochondrial localization of SIRT4 in the HeLa cells (Fig. 1A). To further verify the subcellular localization of SIRT4, HEK293T cells expressing the SIRT4-FLAG protein were fractionated by differential centrifugation in a mitochondria-enriched fraction (HM), a fraction containing microsomes (LM), and into a cytosolic protein fraction (S100). Immunoblot analysis revealed that SIRT4 was exclusively localized in the HM fraction (Fig. 1B). The purity of these fractions was confirmed by probing for the mitochondrial marker cytochrome c and the cytosolic marker Hsp90. To determine if endogenous SIRT4 is also localized to the mitochondria, a rabbit polyclonal antiserum was generated against a peptide corresponding to the last 15 amino acids of human SIRT4. The antiserum reacted strongly with a 29-kDa protein in the mitochondria-enriched fraction of HEK293T cells (Fig. 1C). SIRT4 Is Proteolytically Processed at Its NH2 Terminus—The human SIRT4 cDNA encodes a protein with a predicted molecular mass of 35 kDa. However, both endogenous and FLAG-tagged SIRT4 detected in the mitochondria migrated on SDS-polyacrylamide gels with an apparent molecular mass of 29 kDa. This observation is consistent with the possibility that SIRT4 is proteolytically processed, as observed for many mitochondrial proteins. The polyclonal antiserum used to detect endogenous SIRT4 was raised against its COOH terminus and recognized the shorter for

SUMMARY Cell culture is generally considered to be hyperoxic. However, the importance of cellular oxygen consumption is often underappreciated, with rates of oxygen consumption often sufficient to cause hypoxia at cell monolayers. We initially focused on cultured adipocytes as a terminally differentiated cell-type with substantial oxygen consumption rates to support diverse cellular functions. Under standard conditions, cultured adipocytes are hypoxic and highly glycolytic. Increasing oxygen diverted glucose flux toward mitochondria and resulted in thousands of gene expression changes that pointed toward alleviated physiological transcriptional responses to hypoxia. Phenotypically, providing more oxygen increased adipokine secretion and rendered adipocytes more sensitive to insulin and lipolytic stimuli. The functional benefits of increasing pericellular oxygen were transferable to other cellular systems including hPSC-derived hepatocytes and cardiac organoids. Our findings suggest that oxygen is limiting in many terminally-differentiated cell culture systems, and that controlling oxygen availability can improve the quality and translatability of cell models.

Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2α within the mediobasal hypothalamus is known to suppress food intake, but the role of the eIF2α phosphatases in regulating body weight is poorly understood. Mice deficient in active PPP1R15A, a stress-inducible eIF2α phosphatase, are healthy and more resistant to endoplasmic reticulum stress than wild type controls. We report that when Ppp1r15a mutant mice are fed a high fat diet they gain less weight than wild type littermates owing to reduced food intake. This results in healthy leaner Ppp1r15a mutant animals with reduced hepatic steatosis and improved insulin sensitivity, albeit with a modest defect in insulin secretion. By contrast, no weight differences are observed between wild type and Ppp1r15a deficient mice fed a standard diet. We conclude that mice lacking the C-terminal PP1-binding domain of PPP1R15A show reduced dietary intake and preserved glucose tolerance. Our data indicate that this results in reduced weight gain and protection from diet-induced obesity.

Abstract Objective The metalloprotease ADAM17 (also called TACE) plays fundamental roles in homeostasis by shedding key signaling molecules from the cell surface. Although its importance for the immune system and epithelial tissues is well-documented, little is known about the role of ADAM17 in metabolic homeostasis. The purpose of this study was to determine the impact of ADAM17 expression, specifically in adipose tissues, on metabolic homeostasis. Methods We used histopathology, molecular, proteomic, transcriptomic, in vivo integrative physiological and ex vivo biochemical approaches to determine the impact of adipose tissue-specific deletion of ADAM17 upon adipocyte and whole organism metabolic physiology. Results ADAM17 adipoq-creΔ/Δ mice exhibited a hypermetabolic phenotype characterized by elevated energy consumption and increased levels of adipocyte thermogenic gene expression. On a high fat diet, these mice were more thermogenic, while exhibiting elevated expression levels of genes associated with lipid oxidation and lipolysis. This hypermetabolic phenotype protected mutant mice from obesogenic challenge, limiting weight gain, hepatosteatosis and insulin resistance. Activation of beta-adrenoceptors by the neurotransmitter norepinephrine, a key regulator of adipocyte physiology, triggered the shedding of ADAM17 substrates, and regulated ADAM17 expression at the mRNA and protein levels, hence identifying a functional connection between thermogenic licensing and the regulation of ADAM17. Proteomic studies identified Semaphorin 4B (SEMA4B), as a novel ADAM17-shed adipokine, whose expression is regulated by physiological thermogenic cues that acts to dampen thermogenic responses in adipocytes. Transcriptomic data showed that cleaved SEMA4B acts in an autocrine manner in brown adipocytes to dampen the expression of genes involved in thermogenesis, adipogenesis, lipid uptake, storage and catabolism. Conclusion Our findings identify a novel ADAM17-dependent axis, regulated by beta-adrenoceptors and mediated by the ADAM17-cleaved form of SEMA4B, that may act to limit uncontrolled energy depletion during thermogenesis.

Abstract Increasing brown adipose tissue (BAT) mass and activation has been proposed as a potential therapeutic strategy to treat obesity and associated cardiometabolic complications. Given that obese and diabetic patients possess low amounts of BAT, an efficient way to expand their BAT mass would be necessary if BAT is to be useful. Currently, there is limited knowledge about how human BAT develops, differentiates, and is optimally activated. Moreover, to have access to human BAT is challenging, given its low volume and being anatomically dispersed. These constrain makes detailed mechanistic studies related to BAT development and function in humans virtually impossible. To overcome these limitations, we have developed a human-relevant new protocol for the differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into brown adipocytes (BAs). Unique to this protocol is that it is chemically-defined to recapitulate a physiological step-by-step developmental path of BAT that captures transient paraxial mesoderm and BAT progenitor states, on its way to reaching the adipocyte stage finally. These hPSC-derived BAs express brown adipocyte and thermogenic markers, are insulin sensitive, and respond to β-adrenergic stimuli. This new protocol is a scalable tool to study human BAs during development.