The RNA modification N⁶-methyladenosine (m⁶A) influences mRNA stability and cell-type-specific developmental programming, and is highly abundant in the adult brain. However, it has not been determined whether m⁶A is dynamically regulated by experience. Based on transcriptome-wide profiling of m⁶A, we report that the level of m⁶A increases in the medial prefrontal cortex (mPFC) of mice in response to behavioral experience. The modulation was enriched near the stop codon of mRNAs, including genes related to neuronal plasticity. In primary cortical neurons, in vitro, modulation of m⁶A by the RNA demethylase FTO influenced the degradation profiles of a subset of transcripts with modulated sites. In vivo, the expression of Fto and the m⁶A methyltransferase, Mettl3 correlated with the observed increase in m⁶A levels post-training. Furthermore, targeted knockdown of FTO in the mPFC led to enhanced consolidation of cued fear memory. Thus, together with its role in early development, the dynamic regulation of m⁶A in the adult brain serves as an important epitranscriptomic mechanism associated with behavioral adaptation. SIGNIFICANCE STATEMENTN⁶-methyladenosine (m⁶A) is the most prevalent internal modification on RNA, however, its cellular dynamics in vivo remains elusive. Here we provide the first demonstration of m⁶A upregulation in the mouse medial prefrontal cortex (mPFC) following behavioral training. Knocking down the m⁶A demethylase FTO in the mPFC, which increases total m⁶A level, results in enhanced consolidation of fear memory. Our findings suggest that m⁶A is regulated in an activity-dependent manner in the adult brain, and may function to fine-tune mRNA turnover during memory-related processes.

ABSTRACT Demixing of proteins and nucleic acids into condensed liquid phases is rapidly emerging as a ubiquitous mechanism governing the organisation of molecules within the cell. Long disordered low complexity regions (LCRs) are a common feature of proteins that form biomolecular condensates. RNA-binding proteins with prion-like composition have been highlighted as drivers of liquid demixing to form condensates such as nucleoli, paraspeckles and stress granules. Splicing factor proline- and glutamine-rich (SFPQ) is an RNA- and DNA-binding protein essential for DNA repair and paraspeckle formation. Here, we show that the shorter C-terminal LCR of SFPQ is the main region responsible for the condensation of SFPQ in vitro and in the cell. In contrast, we find that, unexpectedly, the longer N-terminal prion-like LCR of SFPQ attenuates condensation, suggesting a more regulatory role in preventing aberrant condensate formation in the cell. Our data add nuance to the emerging understanding of biomolecular condensate formation, by providing the first example of a common multifunctional nucleic acid-binding protein with an extensive prion-like region that serves to regulate rather than drive condensate formation. Graphical Abstract

Abstract NMDAR-dependent Ca 2+ influx underpins multiple forms of synaptic plasticity. In the adult forebrain, the majority of synaptic NMDAR currents are mediated by GluN2A-containing NMDARs. These receptors are rapidly inserted into synapses during LTP; however, the underlying molecular mechanisms remain poorly understood. Here we show that GluN2A is phosphorylated at Ser-1459 by CaMKIIα in response to glycine stimulation that mimics LTP in primary neurons. Phosphorylation of Ser-1459 promotes GluN2A interaction with the SNX27-retromer complex, therefore enhancing the endosomal recycling of NMDARs. Loss of SNX27 or CaMKIIα function blocks the glycine-induced increase in GluN2A-NMDARs on the neuronal membrane. Interestingly, mutations of Ser-1459, including the rare S1459G human epilepsy variant, prolong decay times of NMDAR-mediated synaptic currents in heterosynapses by increasing the active duration of channel openings. Taken together, these findings not only identify a critical role of Ser-1459 phosphorylation in regulating the function of NMDARs, but also explain how the S1459G epilepsy variant dysregulates NMDAR function.

ABSTRACT SFPQ is a nuclear RNA-binding protein that is involved in a wide range of physiological processes including neuronal development and homeostasis. However, the mislocalization and cytoplasmic aggregation of SFPQ are associated with the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We have previously reported that zinc mediates SFPQ polymerization and promotes the formation of cytoplasmic aggregates in neurons. Here we characterize two familial ALS (fALS)-associated SFPQ variants, which cause amino acid substitutions in the proximity of the SFPQ zinc-coordinating center (N533H and L534I). Both mutants display increased zinc-binding affinities, which can be explained by the presence of a secondary zinc-binding site revealed by the 1.83Å crystal structure of the human SFPQ L534I mutant. Overexpression of these fALS-associated mutants significantly increases the number of SFPQ cytoplasmic aggregates in primary neurons. Although they do not affect the density of dendritic spines, the presence of SFPQ cytoplasmic aggregates causes a marked reduction in the levels of the GluA1, but not the GluA2 subunit of AMPA-type glutamate receptors on the neuronal surface. Taken together, our data demonstrate that fALS-associated mutations enhance the propensity of SFPQ to bind zinc and form aggregates, leading to the dysregulation of AMPA receptor subunit composition, which may contribute to neuronal dysfunction in ALS.

SUMMARY The recruitment of synaptic AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) receptors underlies the strengthening of neuronal connectivity during learning and memory. This process is triggered by NMDA ( N -methyl- D -aspartate) receptor-dependent postsynaptic Ca 2+ influx. Synaptotagmin (Syt)-1 and −7 have been proposed as Ca 2+ -sensors for AMPA receptor exocytosis, but are functionally redundant. Here we identify a cytosolic C2 domain-containing Ca 2+ -binding protein Copine-6 that forms a complex with AMPA receptors. Loss of Copine-6 expression impairs activity-induced exocytosis of AMPA receptors in primary hippocampal neurons, which is rescued by wild-type Copine-6, but not Ca 2+ -binding mutants. In contrast, Copine-6 loss-of-function has no effects on steady-state expression or tetrodotoxin-induced synaptic upscaling of surface AMPA receptors. Loss of Syt-1/-7 significantly reduces Copine-6 protein expression. Interestingly, overexpression of wild-type Copine-6, but not the Ca 2+ -binding mutant, restores activity-dependent exocytosis of AMPA receptors in Syt-1/-7 double-knockdown neurons. We conclude that Copine-6 is a postsynaptic Ca 2+ -sensor that mediates AMPA receptor exocytosis during synaptic potentiation.

SUMMARY Activity-dependent changes in the number of AMPA-type glutamate receptors (AMPARs) at the synapse underpin the expression of long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), cellular correlates of learning and memory. Post-translational ubiquitination has emerged as a key regulator of the trafficking and surface expression of AMPARs, with ubiquitination of the GluA1 subunit at Lys-868 controlling the post-endocytic sorting of the receptors into the late endosome for degradation, and thereby regulating their stability at synapses. However, the physiological significance of GluA1 ubiquitination remains unknown. In this study, we generated mice with a knock-in mutation in the major GluA1 ubiquitination site (K868R) to investigate the role of GluA1 ubiquitination in synaptic plasticity, learning and memory. Our results reveal that these mice have normal basal synaptic transmission but exhibit enhanced LTP and deficits in LTD. They also display deficits in short-term spatial memory and cognitive flexibility. These findings underscore the critical roles of GluA1 ubiquitination for bidirectional synaptic plasticity and cognition.