ABSTRACT Genome editing tools, especially CRISPR/Cas9-based strategies, have transformed biomedical research and opened opportunities for developing curative treatments for genetic diseases. Despite rapid progress, low efficiency of targeted DNA integration and generation of undesired mutations represent major limitations for genome editing applications. Both issues arise from the interplay between the main DNA Double-Strand Break (DSB) repair pathways, Homology-Directed Repair (HDR), Non-Homologous End Joining (NHEJ), and Microhomology-Mediated End Joining (MMEJ). To improve efficiencies of targeted CRISPR-Cas9 genome editing, we screened a large compound library. This led to the discovery of AZD7648, a DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) inhibitor and potent enhancer of CRISPR-Cas9-mediated integration. We demonstrated that AZD7648 increased HDR and decreased mutagenic NHEJ repair, thus resulting in improved performance of precise gene editing. Furthermore, we observed additional improvement of integration efficiency by impairing MMEJ repair through DNA polymerase ⊖ (Pol⊖) inhibition. Combined treatment with AZD7648 and Pol⊖ inhibitors (which we named 2iHDR) substantially increased precision of templated insertions, with efficiencies of up to 80%, and nearly no formation of undesired Insertion-Deletions (InDels). Importantly, 2iHDR also decreased Cas9-associated off-target activity, dramatically improving the performance and fidelity of CRISPR-Cas9 gene editing.

Abstract Prime editing recently emerged as a next-generation approach for precise genome editing. Here we exploit DNA double-strand break (DSB) repair to develop two novel strategies that install precise genomic insertions using an Sp Cas9 nuclease-based prime editor (PEn). We first demonstrate that PEn coupled to a regular prime editing guide RNA (pegRNA) efficiently promotes short genomic insertions through a homology-dependent DSB repair mechanism. While PEn editing lead to increased levels of by-products, it rescued pegRNAs that performed poorly with a nickase-based prime editor. We also present a small molecule approach that yielded increased product purity of PEn editing. Next, we developed a homology-independent PEn editing strategy by engineering a s ingle pr imed in sertion gRNA (springRNA) which installs genomic insertions at DSBs through the non-homologous end joining pathway (NHEJ). Lastly, we show that PEn-mediated insertions at DSBs prevent Cas9-induced large chromosomal deletions and provide evidence that continuous Cas9-mediated cutting is one of the mechanisms by which Cas9-induced large deletions arise. Altogether, this work expands the current prime editing toolbox by leveraging distinct DNA repair mechanisms including NHEJ, which represents the primary pathway of DSB repair in mammalian cells.

Artificial nanoparticles accumulate a protein corona layer in biological fluids, which significantly influences their bioactivity. As nanosized obligate intracellular parasites, viruses share many biophysical properties with artificial nanoparticles in extracellular environments and here we show that respiratory syncytial virus (RSV) and herpes simplex virus 1 (HSV-1) accumulate a rich and distinctive protein corona in different biological fluids. Moreover, we show that corona pre-coating differentially affects viral infectivity and immune cell activation. Additionally, we demonstrate that viruses bind amyloidogenic peptides in their corona and catalyze amyloid formation via surface-assisted heterogeneous nucleation. Importantly, we show that HSV-1 catalyzes the aggregation of the amyloid beta peptide (Aβ42), a major constituent of amyloid plaques in Alzheimer’s disease, in-vitro and in animal models. Our results highlight the viral protein corona as an acquired structural layer that is critical for viral-host interactions and illustrate a mechanistic convergence between viral and amyloid pathologies.