DNA methylation, an important type of epigenetic modification in humans, participates in crucial cellular processes, such as embryonic development, X-inactivation, genomic imprinting and chromosome stability. Several platforms have been developed to study genome-wide DNA methylation. Many investigators in the field have chosen the Illumina Infinium HumanMethylation microarray for its ability to reliably assess DNA methylation following sodium bisulfite conversion. Here, we analyzed methylation profiles of 489 adult males and 357 adult females generated by the Infinium HumanMethylation450 microarray. Among the autosomal CpG sites that displayed significant methylation differences between the two sexes, we observed a significant enrichment of cross-reactive probes co-hybridizing to the sex chromosomes with more than 94% sequence identity. This could lead investigators to mistakenly infer the existence of significant autosomal sex-associated methylation. Using sequence identity cutoffs derived from the sex methylation analysis, we concluded that 6% of the array probes can potentially generate spurious signals because of co-hybridization to alternate genomic sequences highly homologous to the intended targets. Additionally, we discovered probes targeting polymorphic CpGs that overlapped SNPs. The methylation levels detected by these probes are simply the reflection of underlying genetic polymorphisms but could be misinterpreted as true signals. The existence of probes that are cross-reactive or of target polymorphic CpGs in the Illumina HumanMethylation microarrays can confound data obtained from such microarrays. Therefore, investigators should exercise caution when significant biological associations are found using these array platforms. A list of all cross-reactive probes and polymorphic CpGs identified by us are annotated in this paper.

Context

Adjuvant fluorouracil has been shown to be of benefit for patients with resected pancreatic cancer. Gemcitabine is known to be the most effective agent in advanced disease as well as an effective agent in patients with resected pancreatic cancer.

Objective

To determine whether fluorouracil or gemcitabine is superior in terms of overall survival as adjuvant treatment following resection of pancreatic cancer.

Design, Setting, and Patients

The European Study Group for Pancreatic Cancer (ESPAC)-3 trial, an open-label, phase 3, randomized controlled trial conducted in 159 pancreatic cancer centers in Europe, Australasia, Japan, and Canada. Included in ESPAC-3 version 2 were 1088 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma who had undergone cancer resection; patients were randomized between July 2000 and January 2007 and underwent at least 2 years of follow-up.

Interventions

Patients received either fluorouracil plus folinic acid (folinic acid, 20 mg/m², intravenous bolus injection, followed by fluorouracil, 425 mg/m² intravenous bolus injection given 1-5 days every 28 days) (n = 551) or gemcitabine (1000 mg/m² intravenous infusion once a week for 3 of every 4 weeks) (n = 537) for 6 months.

Main Outcome Measures

Primary outcome measure was overall survival; secondary measures were toxicity, progression-free survival, and quality of life.

Results

Final analysis was carried out on an intention-to-treat basis after a median of 34.2 (interquartile range, 27.1-43.4) months' follow-up after 753 deaths (69%). Median survival was 23.0 (95% confidence interval [CI], 21.1-25.0) months for patients treated with fluorouracil plus folinic acid and 23.6 (95% CI, 21.4-26.4) months for those treated with gemcitabine (χ²₁ = 0.7; P = .39; hazard ratio, 0.94 [95% CI, 0.81-1.08]). Seventy-seven patients (14%) receiving fluorouracil plus folinic acid had 97 treatment-related serious adverse events, compared with 40 patients (7.5%) receiving gemcitabine, who had 52 events (P < .001). There were no significant differences in either progression-free survival or global quality-of-life scores between the treatment groups.

Conclusion

Compared with the use of fluorouracil plus folinic acid, gemcitabine did not result in improved overall survival in patients with completely resected pancreatic cancer.

Trial Registration

clinicaltrials.gov Identifier: NCT00058201

The use of liquid biopsies for cancer detection and management is rapidly gaining prominence1. Current methods for the detection of circulating tumour DNA involve sequencing somatic mutations using cell-free DNA, but the sensitivity of these methods may be low among patients with early-stage cancer given the limited number of recurrent mutations2-5. By contrast, large-scale epigenetic alterations-which are tissue- and cancer-type specific-are not similarly constrained6 and therefore potentially have greater ability to detect and classify cancers in patients with early-stage disease. Here we develop a sensitive, immunoprecipitation-based protocol to analyse the methylome of small quantities of circulating cell-free DNA, and demonstrate the ability to detect large-scale DNA methylation changes that are enriched for tumour-specific patterns. We also demonstrate robust performance in cancer detection and classification across an extensive collection of plasma samples from several tumour types. This work sets the stage to establish biomarkers for the minimally invasive detection, interception and classification of early-stage cancers based on plasma cell-free DNA methylation patterns.

Pancreatic cancer is not caused by a specific series of genetic alterations that occur sequentially but by one, or few, catastrophic events that result in simultaneous oncogenic genetic rearrangements, giving rise to highly aggressive tumours. Pancreatic cancer is a highly aggressive tumour type. With a view to examining the evolution of rapid tumour progression in this cancer, this paper presents an analysis of more than a hundred tumour-enriched whole-genome sequences from primary and metastatic pancreas cancers obtained from collaborating hospitals in Canada and the United States of America. Challenging a traditional model of progressive evolution based on ordered mutations in several genes, the authors find support for a role of complex rearrangements and chromothripsis in pancreatic cancer progression, which suggests that the genomic instability that marks this cancer may be explained by a punctuated equilibrium model. Pancreatic cancer, a highly aggressive tumour type with uniformly poor prognosis, exemplifies the classically held view of stepwise cancer development1. The current model of tumorigenesis, based on analyses of precursor lesions, termed pancreatic intraepithelial neoplasm (PanINs) lesions, makes two predictions: first, that pancreatic cancer develops through a particular sequence of genetic alterations2,3,4,5 (KRAS, followed by CDKN2A, then TP53 and SMAD4); and second, that the evolutionary trajectory of pancreatic cancer progression is gradual because each alteration is acquired independently. A shortcoming of this model is that clonally expanded precursor lesions do not always belong to the tumour lineage2,5,6,7,8,9, indicating that the evolutionary trajectory of the tumour lineage and precursor lesions can be divergent. This prevailing model of tumorigenesis has contributed to the clinical notion that pancreatic cancer evolves slowly and presents at a late stage10. However, the propensity for this disease to rapidly metastasize and the inability to improve patient outcomes, despite efforts aimed at early detection11, suggest that pancreatic cancer progression is not gradual. Here, using newly developed informatics tools, we tracked changes in DNA copy number and their associated rearrangements in tumour-enriched genomes and found that pancreatic cancer tumorigenesis is neither gradual nor follows the accepted mutation order. Two-thirds of tumours harbour complex rearrangement patterns associated with mitotic errors, consistent with punctuated equilibrium as the principal evolutionary trajectory12. In a subset of cases, the consequence of such errors is the simultaneous, rather than sequential, knockout of canonical preneoplastic genetic drivers that are likely to set-off invasive cancer growth. These findings challenge the current progression model of pancreatic cancer and provide insights into the mutational processes that give rise to these aggressive tumours.

The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a sensor of products of tryptophan metabolism and a potent modulator of immunity. Here, we examined the impact of AhR in tumor-associated macrophage (TAM) function in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). TAMs exhibited high AhR activity and Ahr-deficient macrophages developed an inflammatory phenotype. Deletion of Ahr in myeloid cells or pharmacologic inhibition of AhR reduced PDAC growth, improved efficacy of immune checkpoint blockade, and increased intra-tumoral frequencies of IFNγ+CD8+ T cells. Macrophage tryptophan metabolism was not required for this effect. Rather, macrophage AhR activity was dependent on Lactobacillus metabolization of dietary tryptophan to indoles. Removal of dietary tryptophan reduced TAM AhR activity and promoted intra-tumoral accumulation of TNFα+IFNγ+CD8+ T cells; provision of dietary indoles blocked this effect. In patients with PDAC, high AHR expression associated with rapid disease progression and mortality, as well as with an immune-suppressive TAM phenotype, suggesting conservation of this regulatory axis in human disease.

Lynch syndrome is a highly penetrant cancer predisposition syndrome caused by germline mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes. We estimated the risks of primary cancers other than colorectal cancer following a diagnosis of colorectal cancer in mutation carriers. We obtained data from the Colon Cancer Family Registry for 764 carriers of an MMR gene mutation (316 MLH1, 357 MSH2, 49 MSH6, and 42 PMS2), who had a previous diagnosis of colorectal cancer. The Kaplan–Meier method was used to estimate their cumulative risk of cancers 10 and 20 years after colorectal cancer. We estimated the age-, sex-, country- and calendar period–specific standardized incidence ratios (SIRs) of cancers following colorectal cancer, compared with the general population. Following colorectal cancer, carriers of MMR gene mutations had the following 10-year risk of cancers in other organs: kidney, renal pelvis, ureter, and bladder (2%, 95% confidence interval [CI] = 1% to 3%); small intestine, stomach, and hepatobiliary tract (1%, 95% CI = 0.2% to 2%); prostate (3%, 95% CI = 1% to 5%); endometrium (12%, 95% CI = 8% to 17%); breast (2%, 95% CI = 1% to 4%); and ovary (1%, 95% CI = 0% to 2%). They were at elevated risk compared with the general population: cancers of the kidney, renal pelvis, and ureter (SIR = 12.54, 95% CI = 7.97 to 17.94), urinary bladder (SIR = 7.22, 95% CI = 4.08 to 10.99), small intestine (SIR = 72.68, 95% CI = 39.95 to 111.29), stomach (SIR = 5.65, 95% CI = 2.32 to 9.69), and hepatobiliary tract (SIR = 5.94, 95% CI = 1.81 to 10.94) for both sexes; cancer of the prostate (SIR = 2.05, 95% CI = 1.23 to 3.01), endometrium (SIR = 40.23, 95% CI = 27.91 to 56.06), breast (SIR = 1.76, 95% CI = 1.07 to 2.59), and ovary (SIR = 4.19, 95% CI = 1.28 to 7.97). Carriers of MMR gene mutations who have already had a colorectal cancer are at increased risk of a greater range of cancers than the recognized spectrum of Lynch syndrome cancers, including breast and prostate cancers.

Abstract Colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death worldwide, and has a strong heritable basis. We report a genome-wide association analysis of 34,627 CRC cases and 71,379 controls of European ancestry that identifies SNPs at 31 new CRC risk loci. We also identify eight independent risk SNPs at the new and previously reported European CRC loci, and a further nine CRC SNPs at loci previously only identified in Asian populations. We use in situ promoter capture Hi-C (CHi-C), gene expression, and in silico annotation methods to identify likely target genes of CRC SNPs. Whilst these new SNP associations implicate target genes that are enriched for known CRC pathways such as Wnt and BMP, they also highlight novel pathways with no prior links to colorectal tumourigenesis. These findings provide further insight into CRC susceptibility and enhance the prospects of applying genetic risk scores to personalised screening and prevention.

ABSTRACT Background With a dismal 8% median 5-year overall survival (OS), pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is highly lethal. Only 10-20% of patients are eligible for surgery, and over 50% of these will die within a year of surgery. Identify molecular predictors of early death would enable the selection of PDAC patients at high risk. Methods We developed the Pancreatic Cancer Overall Survival Predictor (PCOSP), a prognostic model built from a unique set of 89 PDAC tumors where gene expression was profiled using both microarray and sequencing platforms. We used a meta-analysis framework based on the binary gene pair method to create gene expression barcodes robust to biases arising from heterogeneous profiling platforms and batch effects. Leveraging the largest compendium of PDAC transcriptomic datasets to date, we show that PCOSP is a robust single-sample predictor of early death (≤1 yr) after surgery in a subset of 823 samples with available transcriptomics and survival data. Results The PCOSP model was strongly and significantly prognostic with a meta-estimate of the area under the receiver operating curve (AUROC) of 0.70 (P=1.9e-18) and hazard ratio (HR) of 1.95(1.6-2.3) (P=2.6e-16) for binary and survival predictions, respectively. The prognostic value of PCOSP was independent of clinicopathological parameters and molecular subtypes. Over-representation analysis of the PCOSP 2619 gene-pairs (1070 unique genes) unveiled pathways associated with Hedgehog signalling, epithelial mesenchymal transition (EMT) and extracellular matrix (ECM) signalling. Conclusion PCOSP could improve treatment decision by identifying patients who will not benefit from standard surgery/chemotherapy and may benefit from alternate approaches. Abbreviations AUROC Area under the receiver operating curve GO Gene annotation OS Overall survival PCOSP Pancreatic cancer overall survival predictor PDAC Pancreatic ductal adenocarcinoma TSP Top scoring pairs.

Germline copy number variants (CNVs) increase risk for many diseases, yet detection of CNVs and quantifying their contribution to disease risk in large-scale studies is challenging. We developed an approach called CNPBayes to identify latent batch effects, to provide probabilistic estimates of integer copy number across the estimated batches, and to fully integrate the copy number uncertainty in the association model for disease. We demonstrate this approach in a Pancreatic Cancer Case Control study of 7,598 participants where the major sources of technical variation were not captured by study site and varied across the genome. Candidate associations aided by this approach include deletions of 8q24 near regulatory elements of the tumor oncogene MYC and of Tumor Supressor Candidate 3 (TUSC3). This study provides a robust Bayesian inferential framework for estimating copy number and evaluating the role of copy number in heritable diseases.