Summary

 The contribution of cell generation to physiological heart growth and maintenance in humans has been difficult to establish and has remained controversial. We report that the full complement of cardiomyocytes is established perinataly and remains stable over the human lifespan, whereas the numbers of both endothelial and mesenchymal cells increase substantially from birth to early adulthood. Analysis of the integration of nuclear bomb test-derived ¹⁴C revealed a high turnover rate of endothelial cells throughout life (>15% per year) and more limited renewal of mesenchymal cells (<4% per year in adulthood). Cardiomyocyte exchange is highest in early childhood and decreases gradually throughout life to <1% per year in adulthood, with similar turnover rates in the major subdivisions of the myocardium. We provide an integrated model of cell generation and turnover in the human heart. 

Video Abstract

CRISPR-Cas9 enables efficient sequence-specific mutagenesis for creating somatic or germline mutants of model organisms. Key constraints in vivo remain the expression and delivery of active Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes (RNPs) with minimal toxicity, variable mutagenesis efficiencies depending on targeting sequence, and high mutation mosaicism. Here, we apply in vitro assembled, fluorescent Cas9-sgRNA RNPs in solubilizing salt solution to achieve maximal mutagenesis efficiency in zebrafish embryos. MiSeq-based sequence analysis of targeted loci in individual embryos using CrispRVariants, a customized software tool for mutagenesis quantification and visualization, reveals efficient bi-allelic mutagenesis that reaches saturation at several tested gene loci. Such virtually complete mutagenesis exposes loss-of-function phenotypes for candidate genes in somatic mutant embryos for subsequent generation of stable germline mutants. We further show that targeting of non-coding elements in gene regulatory regions using saturating mutagenesis uncovers functional control elements in transgenic reporters and endogenous genes in injected embryos. Our results establish that optimally solubilized, in vitro assembled fluorescent Cas9-sgRNA RNPs provide a reproducible reagent for direct and scalable loss-of-function studies and applications beyond zebrafish experiments that require maximal DNA cutting efficiency in vivo.

Abstract Transgenesis is an essential technique for any genetic model. Tol2-based transgenesis paired with Gateway-compatible vector collections has transformed zebrafish transgenesis with an accessible, modular system. Here, we established several next-generation transgenesis tools for zebrafish and other species to expand and enhance transgenic applications. To facilitate gene-regulatory element testing, we generated Gateway middle entry vectors harboring the small mouse beta-globin minimal promoter coupled to several fluorophores, CreERT2, and Gal4. To extend the color spectrum for transgenic applications, we established middle entry vectors encoding the bright, blue-fluorescent protein mCerulean and mApple as an alternative red fluorophore. We present a series of p2A peptide-based 3’ vectors with different fluorophores and subcellular localizations to co-label cells expressing proteins of interest. Lastly, we established Tol2 destination vectors carrying the zebrafish exorh promoter driving different fluorophores as a pineal gland-specific transgenesis marker active prior to hatching and through adulthood. e xorh -based reporters and transgenesis markers also drive specific pineal gland expression in the eye-less cavefish ( Astyanax ). Together, our vectors provide versatile reagents for transgenesis applications in zebrafish, cavefish, and other models.

Abstract The vertebrate heart integrates cells from the early-differentiating first heart field (FHF) and the later-differentiating second heart field (SHF) emerging from the lateral plate mesoderm. In mammals, this process forms the basis for the development of the left and right ventricle chambers and subsequent chamber septation. The single ventricle-forming zebrafish heart also integrates FHF and SHF lineages during embryogenesis, yet the contributions of these two myocardial lineages to the adult zebrafish heart remain incompletely understood. Here, we characterize the myocardial labeling of FHF descendants in both the developing and adult zebrafish ventricle. Expanding previous findings, late gastrulation-stage labeling using drl -driven CreERT2 recombinase with a myocardium-specific, myl7 -controlled loxP reporter results in predominant labeling of FHF-derived outer curvature and the right side of the embryonic ventricle. Raised to adulthood, such lineage-labeled hearts retain broad areas of FHF cardiomyocytes in a region of the ventricle that is positioned at the opposite side to the atrium and encompasses the apex. Our data add to the increasing evidence for a persisting cell-based compartmentalization of the adult zebrafish ventricle even in the absence of any physical boundary.

Tbx5 is a key transcription factor for vertebrate heart and forelimb development that causes Holt-Oram syndrome when mutated in humans. The classic zebrafish mutant for tbx5a named heartstrings (hst) features recessive absence of pectoral fins and a spectrum of heart defects, most-prominently featuring the name-giving stretched heart tube. The mutation of the hst allele is a stop codon that is predicted to result in a truncated Tbx5a protein that might feature residual activity. Here, using CRISPR-Cas9 mutagenesis, we generated zebrafish strains for two new tbx5a frameshift alleles in the first coding exon: tbx5a c.21_25del and tbx5a c.22_31del, abbreviated as tbx5aΔ5 and tbx5aΔ10. Homozygous and trans-heterozygous combinations of these new tbx5a alleles cause fully penetrant loss of pectoral fins and heart defects including changes in cardiac marker expression akin to hst mutants. Nonetheless, distinct from hst mutants, homozygous and trans-heterozygous combinations of these tbx5a frameshift mutants do not readily manifest the stretched hst heart phenotype. Our observation points out the importance and value of comparing phenotypes from different classes of mutant alleles per gene.

Genetic alterations in human BCL9 genes have repeatedly been found in congenital heart disease (CHD) with as-of-yet unclear causality. BCL9 proteins and their Pygopus (Pygo) co-factors can participate in canonical Wnt signaling via binding to β-catenin. Nonetheless, their contributions to vertebrate heart development remain uncharted. Here, combining zebrafish and mouse genetics, we document tissue-specific functions in canonical Wnt signaling for BCL9 and Pygo proteins during heart development. In a CRISPR-Cas9-based genotype-phenotype association screen, we uncovered that zebrafish mutants for bcl9 and pygo genes largely retain β-catenin activity, yet develop cardiac malformations. In mouse, both systemic and lineage-specific loss of the Pygo-BCL9-β-catenin complex caused heart defects with outflow tract malformations, aberrant cardiac septation and valve formation, and compact myocardium hypoplasia. Mechanistically, these phenotypes coincide with transcriptional deregulation during heart patterning, and Pygo2 associates with β-catenin at cis-regulatory regions of cardiac genes. Taken together, our results establish BCL9 and Pygo as tissue-specific β-catenin co-factors during vertebrate heart development. Our results further implicate alterations in BCL9 and BCL9L in human CHDs as possibly causative.

Fibroblast Growth Factor (FGF) signaling guides multiple developmental processes including body axis formation and specific cell fate patterning. In zebrafish, genetic mutants and chemical perturbations affecting FGF signaling have uncovered key developmental processes; however, these approaches cause embryo-wide FGF signaling perturbations, rendering assessment of cell-autonomous versus non-autonomous requirements for FGF signaling in individual processes difficult. Here, we created the novel transgenic line fgfr1-dn-cargo, encoding dominant-negative Fgfr1 with fluorescent tag under combined Cre/lox and heatshock control to provide spatio-temporal perturbation of FGF signaling. Validating efficient perturbation of FGF signaling by fgfr1-dn-cargo primed with ubiquitous CreERT2, we established that primed, heatshock-induced fgfr1-dn-cargo behaves akin to pulsed treatment with the FGFR inhibitor SU5402. Priming fgfr1-dn-cargo with CreERT2 in the lateral plate mesoderm, we observed selective cardiac and pectoral fin phenotypes without drastic impact on overall embryo patterning. Harnessing lateral plate mesoderm-specific FGF inhibition, we recapitulated the cell-autonomous and temporal requirement for FGF signaling in pectoral fin outgrow, as previously hypothesized from pan-embryonic FGF inhibition. Altogether, our results establish fgfr1-dn-cargo as a genetic tool to define the spatio-temporal requirements for FGF signaling in zebrafish.

The vertebrate heart develops from several progenitor lineages. After early-differentiating first heart field (FHF) progenitors form the linear heart tube, late-differentiating second heart field (SHF) progenitors extend atrium, ventricle, and form the inflow and outflow tracts (IFT/OFT). However, the position and migration of late-differentiating progenitors during heart formation remains unclear. Here, we tracked zebrafish heart development using transgenics based on the cardiopharyngeal transcription factor gene tbx1. Live-imaging uncovered a tbx1 reporter-expressing cell sheath that from anterior lateral plate mesoderm continuously disseminates towards the forming heart tube. High-speed imaging and optogenetic lineage tracing corroborated that the zebrafish ventricle forms through continuous addition from the undifferentiated progenitor sheath followed by late-phase accrual of the bulbus arteriosus (BA). FGF inhibition during sheath migration reduced ventricle size and abolished BA formation, refining the window of FGF action during OFT formation. Our findings consolidate previous end-point analyses and establish zebrafish ventricle formation as a continuous process.

CRISPR-Cas9 and related technologies efficiently alter genomic DNA at targeted positions and have far-reaching implications for functional screening and therapeutic gene editing. Understanding and unlocking this potential requires accurate evaluation of editing efficiency. We show that methodological decisions for analyzing sequencing data can significantly affect mutagenesis efficiency estimates and we provide a comprehensive R-based toolkit, CrispRVariants and accompanying web tool CrispRVariantsLite, that resolves and localizes individual mutant alleles with respect to the endonuclease cut site. CrispRVariants-enabled analyses of newly generated and existing genome editing datasets underscore how careful consideration of the full variant spectrum gives insight toward effective guide and amplicon design as well as the mutagenic process.