The proinflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) is a secreted protein that lacks a signal peptide and does not follow currently known pathways of secretion. Its efficient release from activated immune cells requires a secondary stimulus such as extracellular ATP acting on P2X7 receptors. We show that human THP-1 monocytes shed microvesicles from their plasma membrane within 2–5 s of activation of P2X7 receptors. Two minutes after such stimulation, the released microvesicles contained bioactive IL-1β, which only later appeared in the vesicle-free supernatant. We conclude that microvesicle shedding is a major secretory pathway for rapid IL-1β release from activated monocytes and may represent a more general mechanism for secretion of similar leaderless secretory proteins.

Poxviruses employ many strategies to evade and neutralize the host immune response. In this study, we have identified two vaccinia virus ORFs, termed A46R and A52R, that share amino acid sequence similarity with the Toll/IL-1 receptor (TIR) domain, a motif that defines the IL-1/Toll-like receptor (TLR) superfamily of receptors, which have a key role in innate immunity and inflammation. When expressed in mammalian cells, the protein products of both ORFs were shown to interfere specifically with IL-1 signal transduction. A46R partially inhibited IL-1-mediated activation of the transcription factor NFκB, and A52R potently blocked both IL-1- and TLR4-mediated NFκB activation. MyD88 is a TIR domain-containing adapter molecule known to have a central role in both IL-1 and TLR4 signaling. A52R mimicked the dominant-negative effect of a truncated version of MyD88 on IL-1, TLR4, and IL-18 signaling but had no effect on MyD88-independent signaling pathways. Therefore, A46R and A52R are likely to represent a mechanism used by vaccinia virus of suppressing TIR domain-dependent intracellular signaling.

Enterococcus faecalis is an opportunistic pathogen frequently causing nosocomial infections. The virulence of this organism is underpinned by its capacity to evade phagocytosis, allowing dissemination in the host. Immune evasion requires a surface polysaccharide produced by all enterococci, known as the Enterococcal Polysaccharide Antigen (EPA). EPA consists of a cell wall-anchored rhamnose backbone substituted by strain-specific polysaccharides called decorations, essential for the biological activity of this polymer. However, the structural determinants required for innate immune evasion remain unknown, partly due to a lack of suitable validated assays. Here, we describe a quantitative, in vitro assay to investigate how EPA decorations alter phagocytosis. Using the E. faecalis model strain OG1RF, we demonstrate that a mutant with a deletion of the locus encoding EPA decorations can be used as a platform strain to express heterologous decorations, thereby providing an experimental system to investigate the inhibition of phagocytosis by strain-specific decorations. We show that the aggregation of cells lacking decorations is increasing phagocytosis and that this process does not involve the recognition of lipoproteins by macrophages. Collectively, our work provides novel insights into innate immune evasion by enterococci and paves the way for further studies to explore the structure/function relationship of EPA decorations.

Summary Molecular mechanisms that regulate tumour-associated macrophage (TAM) phenotype and function are incompletely understood. Here, we show that the pseudokinase TRIB1 is highly expressed by TAMs in breast cancer and that its expression correlates with response to chemotherapy and patient survival. We used immune-competent murine models of breast cancer to characterise the consequences of altered (reduced or elevated) myeloid Trib1 expression on tumour growth and composition of stromal immune cells. We found that both overexpression and knockout of myeloid Trib1 promote tumour growth, albeit through distinct molecular mechanisms. Myeloid Trib1 deficiency resulted in an early accelearation of tumour growth, paired with a selective reduction in perivascular macrophage numbers in vivo and enhanced oncogenic cytokine expression in vitro . In contrast, elevated levels of Trib1 in myeloid cells led to an increase in mammary tumour volume at late stages, together with a reduction of NOS2 expressing macrophages and an overall reduction of these cells in hypoxic tumour regions. In addition, we show that myeloid Trib1 is a previously unknown, negative regulator of the anti-tumour cytokine IL-15 and that increased expression of myeloid Trib1 leads to reduced IL-15 levels in mammary tumours, with a consequent reduction in the number of T-cells, that are key to anti-tumour immune responses. Together, these results define the different roles of TRIB1 in human breast cancer and provide a mechanistic understanding for the importance of myeloid TRIB1 expression levels in the development of this disease. Significance TRIB1 expression is strongly associated with response to chemotherapy in breast cancer patients with aggressive tumours. This protein is also highly expressed by tumour-associated macrophages. Thus, we used myeloid-specific alterations of Trib1 expression in mice ( Trib1 mKO and Trib1 mTg ), and characterised consequent changes in the growth rate and tumour microenvironment of mammary tumours. Both Trib1 mKO and Trib1 mTg enhanced tumour growth, but at different stages of tumour growth and via distinct mechanisms. Trib1 mKO significantly increased the expression of oncogenic cytokines, such as IL6, IL10, CCL20, PD-L1, and VEGF. In contrast, Trib1 mTg accelerated at the later stage of tumour growth via inhibition of hypoxic TAMs in the TME, as well as by reduced IL-15 expression thus leading to impaired naïve and cytotoxic T cell infiltration. These data define TRIB1 as a potential novel marker of therapeutic responses in breast cancer, as well as a key mechanistic regulator of the anti-tumour cytokine, IL-15 in myeloid cells.

Heterotopic ossification (HO) is bone formation that occurs after trauma within tissues that do not normally have the property of ossification, resulting in pain and disability. The genetic architecture of HO remains unclear. In the first genome-wide association studies of this disease, we identify the human-only long non-coding RNA-encoding gene CASC20 as a robust, replicating susceptibility locus for HO and KIF26B as a potential severity locus. We find that both CASC20 and KIF26B are expressed in human bone. Both CASC20 and KIF26B expression is upregulated upon BMP2 induced osteogenic differentiation in primary human mesenchymal stem cells, followed by RUNX2 and OSTERIX upregulation and mineralised nodule formation. A CRISPR-Cas9 mediated knockout of Kif26b inhibits BMP2-induced Runx2, Sp7/Osterix, Col1A1, Alp, and Bglap/Osteocalcin expression in a murine myocyte model of osteogenic trans-differentiation, and prevents mineralised nodule formation. These studies provide the first insights into the heritable biology of common, complex HO.

Tuberculosis is a major global health problem and is one of the top 10 causes of death worldwide. There is a pressing need for new treatments that circumvent emerging antibiotic resistance. Mycobacterium tuberculosis parasitises macrophages, reprogramming them to establish a niche in which to proliferate, therefore macrophage manipulation is a potential host-directed therapy if druggable molecular targets could be identified. The pseudokinase Tribbles1 (Trib1) regulates multiple innate immune processes and inflammatory profiles making it a potential drug target in infections. Trib1 controls macrophage function, cytokine production, and macrophage polarisation. Despite wide-ranging effects on leukocyte biology, data exploring the roles of Tribbles in infection in vivo are limited. Here, we identify that human Tribbles1 is expressed in monocytes and is upregulated at the transcript level after stimulation with mycobacterial antigen. To investigate the mechanistic roles of Tribbles in the host response to mycobacteria in vivo, we used a zebrafish Mycobacterium marinum (Mm) infection tuberculosis model. Zebrafish Tribbles family members were characterised and shown to have substantial mRNA and protein sequence homology to their human orthologues. trib1 overexpression was host-protective against Mm infection, reducing burden by approximately 50%. Conversely, trib1 knockdown/knockout exhibited increased infection. Mechanistically, trib1 overexpression significantly increased the levels of proinflammatory factors il-1β and nitric oxide. The host-protective effect of trib1 was found to be dependent on the E3 ubiquitin kinase Cop1. These findings highlight the importance of Trib1 and Cop1 as immune regulators during infection in vivo and suggest that enhancing macrophage TRIB1 levels may provide a tractable therapeutic intervention to improve bacterial infection outcomes in tuberculosis.

Abstract Background Inflammation is a precursor to atherosclerotic plaque destabilisation, leading to ischaemic events such as stroke. Macrophage phenotypes can be altered by the microenvironment, and certain anti-inflammatory agents may, therefore, stabilise plaques and reduce the risk of recurrent ischaemic events. Methods Thirteen carotid plaques were obtained from stroke/ Transient Ischaemic Attack (TIA) patients undergoing carotid endarterectomy. An immunofluorescence stain was used to identify common macrophage markers (pan macrophage: CD68, pro-inflammatory: CD86, anti-inflammatory: MRC1), and a novel analysis technique was used to measure the prevalence of macrophage phenotypes in carotid plaques in relation to other histological features of instability. An in vitro model of human blood-derived macrophages was also developed to evaluate the effect of statins and glucocorticoids on macrophage-specific markers using RT-qPCR, Western Blot and immunofluorescence stain. The physiological effect of dexamethasone was further evaluated on macrophages and human carotid plaques cultured ex vivo . Results The macrophage population (CD68+) in the carotid plaques was dominated by “double-positive” (CD86+MRC1+) macrophages (67.8%), followed by “M1-like” (CD86+MRC1-) (16.5%), “M2-like” (CD86-MRC1+) (8.7%) and “double-negative” (CD86-MRC1-) (7.0%) macrophages. M1-like macrophages were more prevalent in unstable plaque sections than stable ones (p=0.0022). Exposure to dexamethasone increased macrophage MRC1 gene expression in vitro and ex vivo . Dexamethasone also reduced Oxidised Low-Density Lipoprotein Receptor 1 ( OLR1 ) gene and protein expression, leading to a decreased ox-LDL uptake in foam cell assays. This was, in turn, associated with reduced lipid uptake in macrophages, as shown by Oil Red O staining. Conclusions Human macrophages may be “switched” to a less inflammatory phenotype by exposure to clinically relevant concentrations of glucocorticoid, potentially mediated by a reduction in Oxidised LDL uptake. This effect was not observed following macrophage exposure to statins. Glucocorticoids may have a future role in preventing ischaemic events in patients with advanced atherosclerosis. Graphical Abstract Highlights A high prevalence (68% in this study) of carotid plaque macrophages express both pro-inflammatory (CD86) and anti-inflammatory (MRC1) markers. These may represent a novel macrophage population. Human macrophages may be “reprogrammed” to a less inflammatory phenotype following exposure to glucocorticoids. Dexamethasone increased MRC1 and decreased OLR1 expression in macrophages derived from human blood samples in vitro and in cells derived from cultured human carotid plaque tissue ex vivo. This was associated with reduced oxLDL uptake and reduced lipid accumulation in the macrophages. Dexamethasone has the potential to stabilise carotid atherosclerotic plaques in humans.

 Introduction Atherosclerosis is the major underlying cause of heart attack and stroke and, as such, understanding the underlying pathological mechanisms of the disease remains a priority. Whilst neutrophils are the most abundant circulating leukocyte, they are rarely detected within developing plaques. Neutrophil microvesicles (NMVs), large (>0.1µm) extracellular vesicles derived from the plasma membrane, were shown to increase miR-155 in endothelial cells (ECs) at atheroprone sites. This led to exacerbation of plaque formation in a mouse model of atherosclerosis. We hypothesise that NMVs contain other microRNA (miRNA) that may influence atherosclerosis initiation and progression. 

Methods

 NMV were isolated from human peripheral blood neutrophils that were stimulated with 10 ng/mL native (n)LDL, 10 ng/mL oxidised (ox)LDL, or PBS only (unstimulated control). Small RNAs were isolated from NMV using miRNeasy mini kit (Qiagen, Germany) and quantity and quality of isolated RNA determined using NanoPhotometer® N60 spectrophotometer (Geneflow, UK) and a 2100 Bioanalyser (Agilent, UK). Small RNA sequencing analysis was performed using Illumina sequencing platform by Novogen, UK. Sequencing data was processed to obtain the clean reads that aligned to the human reference genome. Data was further processed and visualised using R software. 

Results

 757 miRNAs were detected in NMVs. Of these, 527 miRNAs were expressed in all NMV groups, 55 uniquely expressed in NMVs from n/oxLDL stimulated neutrophils and 36 only in unstimulated control NMVs. The most abundant miRNA in all samples was miR-148a-3p, a miRNA previously shown to enhance plaque formation. High levels of miR-155 were also detected in all samples. 

Conclusion

 NMVs have been found to contain a high abundance of miRNAs, with some expression dependent on the stimulus used for induction of MV release. Target and pathway analysis of these data are ongoing. miRNA previously shown to play a role in plaque formation were among the most highly abundant within NMV suggesting that NMV delivery of miRNA to atherosclerotic plaques may play an important role in exacerbating plaque formation. 

Conflict of Interest

 The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this poster.

Abstract Tuberculosis is a major global health problem and is one of the top 10 causes of death worldwide. There is a pressing need for new treatments that circumvent emerging antibiotic resistance. Mycobacterium tuberculosis parasitises macrophages, reprogramming them to establish a niche in which to proliferate, therefore macrophage manipulation is a potential host-directed therapy if druggable molecular targets could be identified. The pseudokinase Tribbles1 (Trib1) regulates multiple innate immune processes and inflammatory profiles making it a potential drug target in infections. Trib1 controls macrophage function, cytokine production and macrophage polarisation. Despite wide-ranging effects on leukocyte biology, data exploring the roles of Tribbles in infection in vivo are limited. Here, we identify that human Tribbles 1 is expressed in monocytes and is upregulated at the transcript level after stimulation with mycobacterial antigen. To investigate the mechanistic roles of Tribbles in the host response to mycobacteria in vivo , we used a zebrafish Mycobacterium marinum (Mm) infection tuberculosis model. Zebrafish Tribbles family members were characterised and shown to have substantial mRNA and protein sequence homology to their human orthologues. trib1 overexpression was host-protective against Mm infection, reducing burden by approximately 50%. Conversely, trib1 knockdown exhibited increased infection. Mechanistically, trib1 overexpression significantly increased the levels of pro-inflammatory factors il-1 β and nitric oxide. The host-protective effect of trib1 was found to be dependent on the E3 ubiquitin kinase Cop1. These findings highlight the importance of Trib1 and Cop1 as immune regulators during infection in vivo and suggest that enhancing macrophage TRIB1 levels may provide a tractable therapeutic intervention to improve bacterial infection outcomes in tuberculosis.

Background

 Atherosclerotic plaque formation is the underlying cause of heart attack and stroke. Macrophages play a key role in plaque progression. Neutrophils are rarely detected in plaques but have been shown to play an integral role in plaque development. We have previously shown that microvesicles released from stimulated neutrophils are present in plaques and enhance plaque formation. Neutrophil microvesicles (NMV) have been found to modulate macrophage activity in atherosclerosis and are known to contain microRNA that can influence macrophage behaviour. We hypothesise that NMV can interact with macrophages within atherosclerotic plaques and alter macrophage phenotype and function. 

Methods

 To determine whether NMV can cross the endothelium, human coronary artery endothelial cells (HCAEC) were cultured ± TNF on transwell inserts. NMV were stained with PKH lipophilic membrane dye and added to the upper compartment of the transwells at ratios of 1:10, 1:50, and 1:100 HCAEC: NMV. After 24h NMV in the basal chamber were visualised using fluorescent microscopy and quantified using Fiji. To investigate NMV internalisation by macrophages, M0 human monocyte-derived macrophages (HMDM) were treated at a ratio of 1:100 HMDM:PKH stained NMV for periods of 24, 6 and 1h. Following treatment, NMV internalisation was quantified by flow cytometry and visualised using confocal microscopy. Trypan blue was used to quench surface fluorescence and distinguish between adherent and internalised NMV. Modulation of macrophage polarisation by NMV was assessed by RT- qPCR analysis of CD68, CD86, MRC1 and CD163 expression after 24h. 

Results

 NMV were able to cross the endothelium in a dose-dependent manner. NMV also interacted with both stimulated and unstimulated HCAECs. NMV interaction with HMDM occurred rapidly with approximately 10% HMDM being identified as PKH+ve after 1h. Internalization of NMVs by HMDMs increased over time with approximately 64% of PKH+ve cells containing NMV after 24h. However, incubation of HMDM with NMVs did not result in any significant changes in polarisation marker expression after 24h. 

Conclusions

 NMV can cross the endothelial monolayer and interact with macrophages. They are internalised by macrophages but are not able to induce changes in polarisation in the absence of other polarising stimuli. Further investigation is underway to elucidate the mechanisms of NMV internalisation and determine whether NMV can act synergistically with cytokines present in the plaque to influence macrophage polarisation. 

Conflict of Interest

 None