Human MutationVolume 39, Issue 11 p. 1517-1524 SPECIAL ARTICLE Recommendations for interpreting the loss of function PVS1 ACMG/AMP variant criterion Ahmad N. Abou Tayoun, Corresponding Author Ahmad N. Abou Tayoun Ahmad.Tayoun@ajch.ae orcid.org/0000-0002-9134-1673 The Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania The University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Current affiliation: Department of Genetics, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Correspondence Ahmad N. Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Email: Ahmad.Tayoun@ajch.aeSearch for more papers by this authorTina Pesaran, Tina Pesaran Ambry Genetics, Aliso Viejo, CaliforniaSearch for more papers by this authorMarina T. DiStefano, Marina T. DiStefano Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorAndrea Oza, Andrea Oza orcid.org/0000-0003-3125-7119 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorHeidi L. Rehm, Heidi L. Rehm orcid.org/0000-0002-6025-0015 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, Massachusetts Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts The Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorLeslie G. Biesecker, Leslie G. Biesecker Medical Genomics and Metabolic Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MarylandSearch for more papers by this authorSteven M. Harrison, Steven M. Harrison orcid.org/0000-0002-9614-9111 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI), ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI)Search for more papers by this author Ahmad N. Abou Tayoun, Corresponding Author Ahmad N. Abou Tayoun Ahmad.Tayoun@ajch.ae orcid.org/0000-0002-9134-1673 The Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania The University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Current affiliation: Department of Genetics, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Correspondence Ahmad N. Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Email: Ahmad.Tayoun@ajch.aeSearch for more papers by this authorTina Pesaran, Tina Pesaran Ambry Genetics, Aliso Viejo, CaliforniaSearch for more papers by this authorMarina T. DiStefano, Marina T. DiStefano Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorAndrea Oza, Andrea Oza orcid.org/0000-0003-3125-7119 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorHeidi L. Rehm, Heidi L. Rehm orcid.org/0000-0002-6025-0015 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, Massachusetts Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts The Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorLeslie G. Biesecker, Leslie G. Biesecker Medical Genomics and Metabolic Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MarylandSearch for more papers by this authorSteven M. Harrison, Steven M. Harrison orcid.org/0000-0002-9614-9111 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI), ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI)Search for more papers by this author First published: 07 September 2018 https://doi.org/10.1002/humu.23626Citations: 291 ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group Members: Ahmad Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE; Jonathan S. Berg, University of North Carolina, Chapel Hill, NC; Leslie G. Biesecker, co-chair, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD; Steven E. Brenner, University of California, Berkeley, Berkeley, CA; Garry Cutting, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; Sian Ellard, University of Exeter Medical School, Exeter, UK; Marc Greenblatt, University of Vermont, Larner College of Medicine, Burlington, VT; Steven M. Harrison, co-chair, Broad Institute of MIT/Harvard, Cambridge, MA; Matt Hurles, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK; Hyunseok P. Kang, Counsyl, San Francisco, CA; Izabela Karbassi, Quest Diagnostics, Athena Diagnostics, Marlborough, MA; Rachel Karchin, Johns Hopkins University, Baltimore, MD; Jessica L. Mester, GeneDx, Inc., Gaithersburg, MD; Robert L. Nussbaum, Invitae, San Francisco, CA; Anne O'Donnell-Luria, Boston Children's Hospital, Boston, MA; Tina Pesaran, Ambry Genetics, Aliso Viejo, CA; Sharon Plon, Baylor College of Medicine, Houston, TX; Heidi Rehm, Massachusetts General Hospital, Boston, MA; Sean Tavtigian, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; Scott Topper, Color Genomics, Burlingame, CA. For the ClinGen/ClinVar Special Issue Read the full textAboutPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinkedInRedditWechat Abstract The 2015 ACMG/AMP sequence variant interpretation guideline provided a framework for classifying variants based on several benign and pathogenic evidence criteria, including a pathogenic criterion (PVS1) for predicted loss of function variants. However, the guideline did not elaborate on specific considerations for the different types of loss of function variants, nor did it provide decision-making pathways assimilating information about variant type, its location, or any additional evidence for the likelihood of a true null effect. Furthermore, this guideline did not take into account the relative strengths for each evidence type and the final outcome of their combinations with respect to PVS1 strength. Finally, criteria specifying the genes for which PVS1 can be applied are still missing. Here, as part of the ClinGen Sequence Variant Interpretation (SVI) Workgroup's goal of refining ACMG/AMP criteria, we provide recommendations for applying the PVS1 criterion using detailed guidance addressing the above-mentioned gaps. Evaluation of the refined criterion by seven disease-specific groups using heterogeneous types of loss of function variants (n = 56) showed 89% agreement with the new recommendation, while discrepancies in six variants (11%) were appropriately due to disease-specific refinements. Our recommendations will facilitate consistent and accurate interpretation of predicted loss of function variants. Citing Literature Supporting Information Filename Description humu23626-sup-0001-tableS1.xlsx20.7 KB Supporting information Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article. Volume39, Issue11Special Issue: ClinGen and ClinVar – Enabling Genomics in Precision MedicineNovember 2018Pages 1517-1524 This article also appears in:Editor's Choice Articles RelatedInformation

Importance

 Germline pathogenic variants inBRCA1andBRCA2predispose to an increased lifetime risk of breast cancer. However, the relevance of germline variants in other genes from multigene hereditary cancer testing panels is not well defined. 

Objective

 To determine the risks of breast cancer associated with germline variants in cancer predisposition genes. 

Design, Setting, and Participants

 A study population of 65 057 patients with breast cancer receiving germline genetic testing of cancer predisposition genes with hereditary cancer multigene panels. Associations between pathogenic variants in non-BRCA1and non-BRCA2predisposition genes and breast cancer risk were estimated in a case-control analysis of patients with breast cancer and Exome Aggregation Consortium reference controls. The women underwent testing between March 15, 2012, and June 30, 2016. 

Main Outcomes and Measures

 Breast cancer risk conferred by pathogenic variants in non-BRCA1and non-BRCA2predisposition genes. 

Results

 The mean (SD) age at diagnosis for the 65 057 women included in the analysis was 48.5 (11.1) years. The frequency of pathogenic variants in 21 panel genes identified in 41 611 consecutively tested white women with breast cancer was estimated at 10.2%. After exclusion ofBRCA1,BRCA2, and syndromic breast cancer genes (CDH1,PTEN, andTP53), observed pathogenic variants in 5 of 16 genes were associated with high or moderately increased risks of breast cancer:ATM(OR, 2.78; 95% CI, 2.22-3.62),BARD1(OR, 2.16; 95% CI, 1.31-3.63),CHEK2(OR, 1.48; 95% CI, 1.31-1.67),PALB2(OR, 7.46; 95% CI, 5.12-11.19), andRAD51D(OR, 3.07; 95% CI, 1.21-7.88). Conversely, variants in theBRIP1andRAD51Covarian cancer risk genes; theMRE11A,RAD50, andNBNMRN complex genes; theMLH1andPMS2mismatch repair genes; andNF1were not associated with increased risks of breast cancer. 

Conclusions and Relevance

 This study establishes several panel genes as high- and moderate-risk breast cancer genes and provides estimates of breast cancer risk associated with pathogenic variants in these genes among individuals qualifying for clinical genetic testing.

The aim of this study was to determine the clinical and molecular characteristics of 2,079 patients who underwent hereditary cancer multigene panel testing.Panels included comprehensive analysis of 14-22 cancer susceptibility genes (BRCA1 and BRCA2 not included), depending on the panel ordered (BreastNext, OvaNext, ColoNext, or CancerNext). Next-generation sequencing and deletion/duplication analyses were performed for all genes except EPCAM (deletion/duplication analysis only). Clinical histories of ColoNext patients harboring mutations in genes with well-established diagnostic criteria were assessed to determine whether diagnostic/testing criteria were met.Positive rates were defined as the proportion of patients with a pathogenic mutation/likely pathogenic variant(s) and were as follows: 7.4% for BreastNext, 7.2% for OvaNext, 9.2% for ColoNext, and 9.6% for CancerNext. Inconclusive results were found in 19.8% of BreastNext, 25.6% of OvaNext, 15.1% of ColoNext, and 23.5% of CancerNext tests. Based on information submitted by clinicians, 30% of ColoNext patients with mutations in genes with well-established diagnostic criteria did not meet corresponding criteria.Our data point to an important role for targeted multigene panels in diagnosing hereditary cancer predisposition, particularly for patients with clinical histories spanning several possible diagnoses and for patients with suspicious clinical histories not meeting diagnostic criteria for a specific hereditary cancer syndrome.

Recommendations from the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP) for interpreting sequence variants specify the use of computational predictors as "supporting" level of evidence for pathogenicity or benignity using criteria PP3 and BP4, respectively. However, score intervals defined by tool developers, and ACMG/AMP recommendations that require the consensus of multiple predictors, lack quantitative support. Previously, we described a probabilistic framework that quantified the strengths of evidence (supporting, moderate, strong, very strong) within ACMG/AMP recommendations. We have extended this framework to computational predictors and introduce a new standard that converts a tool's scores to PP3 and BP4 evidence strengths. Our approach is based on estimating the local positive predictive value and can calibrate any computational tool or other continuous-scale evidence on any variant type. We estimate thresholds (score intervals) corresponding to each strength of evidence for pathogenicity and benignity for thirteen missense variant interpretation tools, using carefully assembled independent data sets. Most tools achieved supporting evidence level for both pathogenic and benign classification using newly established thresholds. Multiple tools reached score thresholds justifying moderate and several reached strong evidence levels. One tool reached very strong evidence level for benign classification on some variants. Based on these findings, we provide recommendations for evidence-based revisions of the PP3 and BP4 ACMG/AMP criteria using individual tools and future assessment of computational methods for clinical interpretation.

Germline genetic testing with hereditary cancer gene panels can identify women at increased risk of breast cancer. However, those at increased risk of triple-negative (estrogen receptor–negative, progesterone receptor–negative, human epidermal growth factor receptor–negative) breast cancer (TNBC) cannot be identified because predisposition genes for TNBC, other than BRCA1, have not been established. The aim of this study was to define the cancer panel genes associated with increased risk of TNBC. Multigene panel testing for 21 genes in 8753 TNBC patients was performed by a clinical testing laboratory, and testing for 17 genes in 2148 patients was conducted by a Triple Negative Breast Cancer Consortium (TNBCC) of research studies. Associations between deleterious mutations in cancer predisposition genes and TNBC were evaluated using results from TNBC patients and reference controls. Germline pathogenic variants in BARD1, BRCA1, BRCA2, PALB2, and RAD51D were associated with high risk (odds ratio > 5.0) of TNBC and greater than 20% lifetime risk for overall breast cancer among Caucasians. Pathogenic variants in BRIP1, RAD51C, and TP53 were associated with moderate risk (odds ratio > 2) of TNBC. Similar trends were observed for the African American population. Pathogenic variants in these TNBC genes were detected in 12.0% (3.7% non-BRCA1/2) of all participants. Multigene hereditary cancer panel testing can identify women with elevated risk of TNBC due to mutations in BARD1, BRCA1, BRCA2, PALB2, and RAD51D. These women can potentially benefit from improved screening, risk management, and cancer prevention strategies. Patients with mutations may also benefit from specific targeted therapeutic strategies.

The ENIGMA research consortium develops and applies methods to determine clinical significance of variants in hereditary breast and ovarian cancer genes. An ENIGMA BRCA1/2 classification sub-group, formed in 2015 as a ClinGen external expert panel, evolved into a ClinGen internal Variant Curation Expert Panel (VCEP) to align with Food and Drug Administration recognized processes for ClinVar contributions. The VCEP reviewed American College of Medical Genetics and Genomics/Association of Molecular Pathology (ACMG/AMP) classification criteria for relevance to interpreting BRCA1 and BRCA2 variants. Statistical methods were used to calibrate evidence strength for different data types. Pilot specifications were tested on 40 variants and documentation revised for clarity and ease of use. The original criterion descriptions for 13 evidence codes were considered non-applicable or overlapping with other criteria. Scenario of use was extended or re-purposed for eight codes. Extensive analysis and/or data review informed specification descriptions and weights for all codes. Specifications were applied to pilot variants with pre-existing ClinVar classification as follows: 13 uncertain significance or conflicting, 14 pathogenic and/or likely pathogenic, and 13 benign and/or likely benign. Review resolved classification for 11/13 uncertain significance or conflicting variants and retained or improved confidence in classification for the remaining variants. Alignment of pre-existing ENIGMA research classification processes with ACMG/AMP classification guidelines highlighted several gaps in the research processes and the baseline ACMG/AMP criteria. Calibration of evidence strength was key to justify utility and strength of different data types for gene-specific application. The gene-specific criteria demonstrated value for improving ACMG/AMP-aligned classification of BRCA1 and BRCA2 variants.

Germline BRCA2 loss-of function variants, which can be identified through clinical genetic testing, predispose to several cancers1–5. However, variants of uncertain significance limit the clinical utility of test results. Thus, there is a need for functional characterization and clinical classification of all BRCA2 variants to facilitate the clinical management of individuals with these variants. Here we analysed all possible single-nucleotide variants from exons 15 to 26 that encode the BRCA2 DNA-binding domain hotspot for pathogenic missense variants. To enable this, we used saturation genome editing CRISPR–Cas9-based knock-in endogenous targeting of human haploid HAP1 cells6. The assay was calibrated relative to nonsense and silent variants and was validated using pathogenic and benign standards from ClinVar and results from a homology-directed repair functional assay7. Variants (6,959 out of 6,960 evaluated) were assigned to seven categories of pathogenicity based on a VarCall Bayesian model8. Single-nucleotide variants that encode loss-of-function missense variants were associated with increased risks of breast cancer and ovarian cancer. The functional assay results were integrated into models from ClinGen, the American College of Medical Genetics and Genomics, and the Association for Molecular Pathology9 for clinical classification of BRCA2 variants. Using this approach, 91% were classified as pathogenic or likely pathogenic or as benign or likely benign. These classified variants can be used to improve clinical management of individuals with a BRCA2 variant. Results from a comprehensive evaluation of the function of BRCA2 variants, particularly variants of uncertain significance, provide a useful resource to improve the clinical management of individuals who carry such genetic variants.

The 2015 ACMG/AMP sequence variant interpretation guideline provided a framework for classifying variants based on several benign and pathogenic evidence criteria. This guideline includes a pathogenic criterion (PVS1) for predicted loss of function variants. However, the guideline did not elaborate on the specific considerations for the different types of loss of function variants, nor did it provide decision-making pathways assimilating information about the variant type, its location within the gene, or any additional evidence for the likelihood of a true null effect. Furthermore, the ACMG/AMP guideline did not take into account the relative strengths for each evidence type and the final outcome of their combinations with respect to PVS1 strength. Finally, criteria specifying the genes for which PVS1 can be used are still missing. Here, as part of the Clinical Genomic Resource (ClinGen) Sequence Variant Interpretation (SVI) Working Groups goal of refining ACMG/AMP criteria, we provide recommendations for applying the PVS1 rule using detailed guidance addressing all the above-mentioned gaps. We evaluate the performance of the refined rule using heterogeneous types of loss of function variants (n= 56) curated by seven disease-specific groups across ten genes. Our recommendations will facilitate consistent and accurate interpretation of predicted loss of function variants.

10511 Background: Germline BRCA2 loss-of function (LOF) variants identified by clinical genetic testing predispose to breast, ovarian, prostate and pancreatic cancer. However, variants of uncertain significance (VUS) (n > 4000) limit the clinical use of testing results. Thus, there is an urgent need for functional characterization and clinical classification of all BRCA2 variants. Here we report on comprehensive saturation genome editing (SGE)-based functional characterization of 97% of all possible single nucleotide variants (SNVs) in the BRCA2 DNA Binding Domain hotspot encoded by exons 15 to 26 for pathogenic missense variants. Methods: SGE of exons 15 to 26 of BRCA2(MANE transcript ENST00000380152.8) was performed in the haploid human HAP1 cell line. Each exon along with 10bp flanking intronic sequence was studied as an independent target region. The most efficient sgRNA for each target region was selected and cloned into a Cas9 expressing plasmid. Site-saturation mutagenesis (SSM) libraries for each of the 14 target regions were designed to target every nucleotide and were generated by site directed mutagenesis using NNN-tailed PCR primers. HAP1 cells were transfected and harvested at Day5 and 14. Cell survival in response to each variant was assessed based on deep sequence analysis of the surviving endogenously targeted HAP1 cells at Day 5 and Day 14. Results: A total of 7013 SNVs were characterized as functionally abnormal (n = 955), intermediate/uncertain, or functionally normal (n = 5224) based on 95% precision for ClinVar known pathogenic and benign standards. Results were validated relative to batches of nonsense and synonymous variants and variants evaluated using a homology directed repair (HDR) functional assay. Breast cancer case-control association studies showed that pooled SNVs encoding functionally abnormal missense variants were associated with increased risk of breast cancer (odds ratio (OR) 3.89, 95%CI: 2.77-5.51). The functional data were added to other sources of information in a ClinGen/ACMG/AMP-like model and 700 functionally abnormal SNVs, including 220 missense SNVs, were classified as pathogenic or likely pathogenic, while 4862 functionally normal SNVs, including 3084 missense SNVs, were classified as benign or likely benign. Conclusions: The production of functional maps for 97% of all SNVs in the BRCA2 DBD allowed for separation of nucleotide/protein-level functional aberrations. When coupled with genetic and clinical sources of evidence this study led to clinical classification of 5500 individual variants. These data will prove useful in the future, through integration with other datasets, for characterization and clinical classification of all variants in this region in individuals from all racial and ethnic backgrounds and for all BRCA2 associated forms of cancer.