The crystal structure of the human DNA polymerase δ processivity factor PCNA (proliferating cell nuclear antigen) complexed with a 22 residue peptide derived from the C-terminus of the cell-cycle checkpoint protein p21WAF1/CIP1 has been determined at 2.6 Å resolution. p21 binds to PCNA in a 1:1 stoichiometry with an extensive array of interactions that include the formation of a β sheet with the interdomain connector loop of PCNA. An intact trimeric ring is maintained in the structure of the p21–PCNA complex, with a central hole available for DNA interaction. The ability of p21 to inhibit the action of PCNA is therefore likely to be due to its masking of elements on PCNA that are required for the binding of other components of the polymerase assembly.

Abstract

 The crystal structure of the β subunit (processivity factor) of DNA polymerase III holoenzyme has been determined at 2.5 Å resolution. A dimer of the β subunit (M_r = 2 × 40.6 kd, 2 × 366 amino acid residues) forms a ring-shaped structure lined by 12 α helices that can encircle duplex DNA. The structure is highly symmetrical, with each monomer containing three domains of identical topology. The charge distribution and orientation of the helices indicate that the molecule functions by forming a tight clamp that can slide on DNA, as shown biochemically. A potential structural relationship is suggested between the β subunit and proliferating cell nuclear antigen (PCNA, the eukaryotic polymerase δ [and ε] processivity factor), and the gene 45 protein of the bacteriophage T4 DNA polymerase.

The damage-inducible UmuD′ and UmuC proteins are required for most SOS mutagenesis in Escherichia coli . Our recent assay to reconstitute this process in vitro , using a native UmuD′ 2 C complex, revealed that the highly purified preparation contained DNA polymerase activity. Here we eliminate the possibility that this activity is caused by a contaminating DNA polymerase and show that it is intrinsic to UmuD′ 2 C. E. coli dinB has recently been shown to have DNA polymerase activity (pol IV). We suggest that UmuD′ 2 C, the fifth DNA polymerase discovered in E. coli , be designated as E. coli pol V. In the presence of RecA, β sliding clamp, γ clamp loading complex, and E. coli single-stranded binding protein (SSB), pol V’s polymerase activity is highly “error prone” at both damaged and undamaged DNA template sites, catalyzing efficient bypass of abasic lesions that would otherwise severely inhibit replication by pol III holoenzyme complex (HE). Pol V bypasses a site-directed abasic lesion with an efficiency about 100- to 150-fold higher than pol III HE. In accordance with the “A-rule,” dAMP is preferentially incorporated opposite the lesion. A pol V mutant, UmuD′ 2 C104 (D101N), has no measurable lesion bypass activity. A kinetic analysis shows that addition of increasing amounts of pol III to a fixed level of pol V inhibits lesion bypass, demonstrating that both enzymes compete for free 3′-OH template-primer ends. We show, however, that despite competition for primer-3′-ends, pol V and pol III HE can nevertheless interact synergistically to stimulate synthesis downstream from a template lesion.

DNA polymerase III holoenzyme (holoenzyme), the multiprotein replicase of Escherichia coli, is essentially unlimited in processive DNA synthesis. Processive activity can be reconstituted from two components. One component, the beta preinitiation complex, is a beta dimer clamped onto primed DNA. The beta preinitiation complex is formed by the five-protein gamma complex, which hydrolyzes ATP to chaperone beta onto primed DNA. The other component is the alpha epsilon polymerase. The alpha epsilon polymerase itself is not processive, but is endowed with extremely high processive activity upon assembly with the beta preinitiation complex. Here we examine the mechanism by which the beta preinitiation complex confers processivity onto the alpha epsilon polymerase. We find the beta preinitiation complex to be mobile on DNA. Diffusion of beta on DNA is specific to duplex DNA, is bidirectional, does not require ATP, and appears to diffuse linearly along the duplex. Furthermore, beta directly binds the alpha epsilon polymerase through contact with alpha, the DNA polymerase subunit. Hence, the high processivity of the holoenzyme is rooted in a sliding clamp of beta on DNA that tethers the polymerase to the primed template. Implications for transcription and translation are discussed.

Cdk-interacting protein 1 (Cip1) is a p53-regulated 21-kDa protein that inhibits several members of the cyclin-dependent kinase (CDK) family. It was initially observed in complexes containing CDK4, cyclin D, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). PCNA, in conjunction with activator 1, acts as a processivity factor for eukaryotic DNA polymerase (pol) delta, and these three proteins constitute the pol delta holoenzyme. In this report, we demonstrate that Cip1 can also directly inhibit DNA synthesis in vitro by binding to PCNA. Cip1 efficiently inhibits simian virus 40 replication dependent upon pol alpha, activator 1, PCNA, and pol delta, and this inhibition can be overcome by additional PCNA. Simian virus 40 DNA replication, catalyzed solely by high levels of pol alpha-primase complex, is unaffected by Cip1. Using the surface plasmon resonance technique, a direct physical interaction of PCNA and Cip1 was detected. We have observed that Cip1 efficiently inhibits synthesis of long (7.2 kb) but not short (10 nt) templates, suggesting that its association with PCNA is likely to impair the processive movement of pol delta during DNA chain elongation, as opposed to blocking assembly of the pol delta holoenzyme. The implications of the Cip1-PCNA interaction with respect to regulation of DNA synthesis, cell cycle checkpoint control, and DNA repair are discussed.

The conversion of chemical energy into mechanical force by AAA+ (ATPases associated with diverse cellular activities) ATPases is integral to cellular processes, including DNA replication, protein unfolding, cargo transport and membrane fusion. The AAA+ ATPase motor cytoplasmic dynein regulates ciliary trafficking, mitotic spindle formation and organelle transport, and dissecting its precise functions has been challenging because of its rapid timescale of action and the lack of cell-permeable, chemical modulators. Here we describe the discovery of ciliobrevins, the first specific small-molecule antagonists of cytoplasmic dynein. Ciliobrevins perturb protein trafficking within the primary cilium, leading to their malformation and Hedgehog signalling blockade. Ciliobrevins also prevent spindle pole focusing, kinetochore-microtubule attachment, melanosome aggregation and peroxisome motility in cultured cells. We further demonstrate the ability of ciliobrevins to block dynein-dependent microtubule gliding and ATPase activity in vitro. Ciliobrevins therefore will be useful reagents for studying cellular processes that require this microtubule motor and may guide the development of additional AAA+ ATPase superfamily inhibitors.

DNA-damaging agents are among the most frequently used anticancer drugs. However, they provide only modest benefit in most cancers. This may be attributed to a genome maintenance network, the DNA damage response (DDR), that recognizes and repairs damaged DNA. ATR is a major regulator of the DDR and an attractive anticancer target. Herein, we describe the discovery of a series of aminopyrazines with potent and selective ATR inhibition. Compound 45 inhibits ATR with a K(i) of 6 nM, shows >600-fold selectivity over related kinases ATM or DNA-PK, and blocks ATR signaling in cells with an IC(50) of 0.42 μM. Using this compound, we show that ATR inhibition markedly enhances death induced by DNA-damaging agents in certain cancers but not normal cells. This differential response between cancer and normal cells highlights the great potential for ATR inhibition as a novel mechanism to dramatically increase the efficacy of many established drugs and ionizing radiation.

Significance All cellular life forms use a ring-shaped hexameric helicase during DNA replication. CMG (Cdc45, Mcm2–7, GINS) is the eukaryotic replicative helicase. CMG contains the ring-shaped hexameric Mcm2–7 that harbors the helicase motors. CMG is known to bind many other proteins, including a leading and lagging polymerase and primase. Thus, the threading of DNA through the CMG helicase at a replication fork determines the orientation of the associated polymerases at the replication fork, an important structural feature with many consequences that may direct future experimentation. This report uses cryo-EM single-particle reconstruction to image CMG that motored to a block site at a forked junction, enabling direct visualization of DNA threading through CMG.