Signaling by the epidermal growth factor receptor requires an allosteric interaction between the kinase domains of two receptors, whereby one activates the other. We show that the intracellular juxtamembrane segment of the receptor, known to potentiate kinase activity, is able to dimerize the kinase domains. The C-terminal half of the juxtamembrane segment latches the activated kinase domain to the activator, and the N-terminal half of this segment further potentiates dimerization, most likely by forming an antiparallel helical dimer that engages the transmembrane helices of the activated receptor. Our data are consistent with a mechanism in which the extracellular domains block the intrinsic ability of the transmembrane and cytoplasmic domains to dimerize and activate, with ligand binding releasing this block. The formation of the activating juxtamembrane latch is prevented by the C-terminal tails in a structure of an inactive kinase domain dimer, suggesting how alternative dimers can prevent ligand-independent activation.

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase-II (CaMKII) is unique among protein kinases for its dodecameric assembly and its complex response to Ca2+. The crystal structure of the autoinhibited kinase domain of CaMKII, determined at 1.8 Å resolution, reveals an unexpected dimeric organization in which the calmodulin-responsive regulatory segments form a coiled-coil strut that blocks peptide and ATP binding to the otherwise intrinsically active kinase domains. A threonine residue in the regulatory segment, which when phosphorylated renders CaMKII calmodulin independent, is held apart from the catalytic sites by the organization of the dimer. This ensures a strict Ca2+ dependence for initial activation. The structure of the kinase dimer, when combined with small-angle X-ray scattering data for the holoenzyme, suggests that inactive CaMKII forms tightly packed autoinhibited assemblies that convert upon activation into clusters of loosely tethered and independent kinase domains.

ABSTRACT The chromatin remodeler ALC1 is recruited to and activated by DNA damage-induced poly(ADP-ribose) (PAR) chains deposited by PARP1/PARP2/HPF1 upon detection of DNA lesions. ALC1 has emerged as a candidate drug target for cancer therapy as its loss confers synthetic lethality in homologous recombination-deficient cells. However, structure-based drug design and molecular analysis of ALC1 have been hindered by the requirement for PARylation and the highly heterogeneous nature of this post-translational modification. Here, we reconstituted an ALC1 and PARylated nucleosome complex modified in vitro using PARP2 and HPF1. This complex was amenable to cryo-EM structure determination without cross-linking, which enabled visualization of several intermediate states of ALC1 from the recognition of the PARylated nucleosome to the tight binding and activation of the remodeler. Functional biochemical assays with PARylated nucleosomes highlight the importance of nucleosomal epitopes for productive remodeling and reveal that ALC1 preferentially slides nucleosomes away from DNA breaks.

Abstract Sequence-specific binding of proteins to DNA is essential for accessing genetic information. Here, we derive a simple equation for target-site recognition, which uncovers a previously unrecognized coupling between the macroscopic association and dissociation rates of the searching protein. Importantly, this relationship makes it possible to recover the relevant microscopic rates from experimentally determined macroscopic ones. We directly test the equation by observing the binding and unbinding of individual lac repressor (LacI) molecules during target search. We find that LacI dissociates from different target sequences with essentially identical microscopic dissociation rates. Instead, sequence specificity is determined by the efficiency with which the protein recognizes different targets, effectively reducing its risk of being retained on a non-target sequence. Our theoretical framework also accounts for the coupling between off-target binding and unbinding of the catalytically inactive Cas9 (dCas9), showing that the binding pathway can be obtained from macroscopic data. One Sentence Summary Association and dissociation rates are anti-correlated for reactions that include a nonspecific probing step.

Many proteins that bind specific DNA sequences search the genome by combining three dimensional (3D) diffusion in the cytoplasm with one dimensional (1D) sliding on non-specific regions of the DNA. It is however not known how sliding proteins are oriented with respect to DNA in order to recognize specific sequences. Here we measure the polarization of fluorescence emission from single fluorescently labeled lac repressor (LacI) molecules sliding on stretched DNA. Real-time feedback-coupled confocal single-particle tracking allows us to measure fluorescence correlation of the sliding molecules. We find that the fluctuations in the fluorescence signal on the μs timescale are accurately described by rotation-coupled sliding on DNA. On average, LacI moves ~50 base pairs per revolution, which is significantly longer than the 10.5 bp helical periodicity of DNA. Our data support a facilitated diffusion model where the transcription factor (TF) scans the DNA grooves for hydrogen bonding opportunities in a pre-aligned orientation with occasional slippage out of the groove.

Despite their canonical two-fold symmetry, nucleosomes in biological contexts are often asymmetric: functionalized with post-translational modifications (PTMs), substituted with histone variants, and even lacking H2A/H2B dimers. Here we show that the Widom 601 nucleosome positioning sequence can be used to produce hexasomes in a specific orientation on DNA, which provide a useful tool for interrogating chromatin enzymes and allow for the generation of precisely defined asymmetry in nucleosomes. Using this methodology, we demonstrate that the Chd1 chromatin remodeler requires H2A/H2B on the entry side for sliding, and thus, unlike the back-and-forth sliding observed for nucleosomes, Chd1 shifts hexasomes unidirectionally. Chd1 takes part in chromatin reorganization surrounding transcribing RNA polymerase II (Pol II), and using asymmetric nucleosomes we show that ubiquitin-conjugated H2B on the entry side stimulates nucleosome sliding by Chd1. We speculate that biased nucleosome and hexasome sliding due to asymmetry contributes to the packing of arrays observed in vivo.

Many proteins that bind specific DNA sequences search the genome by combining three dimensional (3D) diffusion in the cytoplasm with one dimensional (1D) sliding on non-specific DNA. Here we combine resonance energy transfer and fluorescence correlation measurements to characterize how individual lac repressor (LacI) molecules explore DNA during the 1D phase of target search. To track the rotation of sliding LacI molecules on the microsecond time scale during DNA surface search, we use real-time single-molecule confocal laser tracking combined with fluorescence correlation spectroscopy (SMCT-FCS). The fluorescence signal fluctuations are accurately described by rotation-coupled sliding, where LacI traverses ~40 base pairs (bp) per revolution. This distance substantially exceeds the 10.5-bp helical pitch of DNA, suggesting that the sliding protein frequently hops out of the DNA groove, which would result in frequent bypassing of target sequences. Indeed, we directly observe such bypassing by single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET). A combined analysis of the smFRET and SMCT-FCS data shows that LacI at most hops one to two grooves (10-20 bp) every 250 μs. Overall, our data suggest a speed-accuracy trade-off during sliding; the weak nature of non-specific protein-DNA interactions underlies operator bypassing but also facilitates rapid sliding. We anticipate that our SMCT-FCS method to monitor rotational diffusion on the microsecond time scale while tracking individual molecules with millisecond time resolution will be applicable to the real-time investigation of many other biological interactions and effectively extends the accessible time regime by two orders of magnitude.