ABSTRACT Plants expend significant resources to select and maintain rhizosphere communities that benefit their growth and protect them from pathogens. A better understanding of assembly and function of rhizosphere microbial communities will provide new avenues for improving crop production. Secretion of antibiotics is one means by which bacteria interact with neighboring microbes and sometimes change community composition. In our analysis of a taxonomically diverse consortium from the soybean rhizosphere, we found that Pseudomonas koreensis selectively inhibits growth of Flavobacterium johnsoniae and other members of the Bacteroidetes grown in soybean root exudate. A genetic screen in P. koreensis identified a previously uncharacterized biosynthetic gene cluster responsible for the inhibitory activity. The metabolites were isolated based on biological activity and were characterized using tandem-mass spectrometry, multidimensional NMR, and Mosher ester analysis, leading to the discovery of a new family of bacterial piperidine alkaloids, koreenceine A-D ( 1–4 ). Three of these metabolites are analogs of the plant alkaloid γ-coniceine. Comparative analysis of the koreenceine cluster with the γ-coniceine pathway revealed distinct polyketide synthase (PKS) routes to the defining piperidine scaffold, suggesting convergent evolution. Koreenceine-type pathways are widely distributed among Pseudomonas species, and koreenceine C was detected in another Pseudomonas sp. from a distantly related cluster. This work suggests that Pseudomonas and plants convergently evolved the ability to produce similar alkaloid metabolites that can mediate inter-bacterial competition in the rhizosphere. IMPORTANCE The microbiomes of plants are critical to host physiology and development. Microbes are attracted to the rhizosphere due to massive secretion of plant photosynthates from roots. Microorganisms that successfully join the rhizosphere community from bulk soil have access to more abundant and diverse molecules, producing a highly competitive and selective environment. In the rhizosphere, as in other microbiomes, there is little known about the genetic basis for individual species’ behaviors within the community. In this study, we characterized competition between Pseudomonas koreensis and Flavobacterium johnsoniae , two common rhizosphere inhabitants. We identified a widespread gene cluster in several Pseudomonas spp., which is necessary for the production of a novel family of piperidine alkaloids that are structural analogs of plant alkaloids. We expand the known repertoire of antibiotics produced from Pseudomonas in the rhizosphere and demonstrate the role of the metabolites in interactions with other bacteria of the rhizosphere.

Abstract Pseudomonas aeruginosa is recognized for its ability to colonize diverse habitats and cause disease in a variety of hosts, including plants, invertebrates, and mammals. Understanding how this bacterium is able to occupy wide-ranging niches is important for deciphering its ecology. We used transposon sequencing (Tn-Seq, also known as INSeq) to identify genes in P. aeruginosa that contribute to fitness during colonization of Drosophila melanogaster . Our results reveal a suite of critical factors, including those that contribute to polysaccharide production, DNA repair, metabolism, and respiration. Comparison of candidate genes with fitness determinants discovered in previous studies of P. aeruginosa identified several genes required for colonization and virulence determinants that are conserved across hosts and tissues. This analysis provides evidence for both the conservation of function of several genes across systems, as well as host-specific functions. These findings, which represent the first use of transposon sequencing of a gut pathogen in Drosophila , demonstrate the power of Tn-Seq in the fly model system and advance existing knowledge of intestinal pathogenesis by D. melanogaster, revealing bacterial colonization determinants that contribute to a comprehensive portrait of P . aeruginosa lifestyles across habitats. Importance Drosophila melanogaster is a powerful model for understanding host-pathogen interactions. Research with this system has yielded notable insights into mechanisms of host immunity and defense, many of which emerged from analysis of bacterial mutants defective for well-characterized virulence factors. These foundational studies – and advances in high-throughput sequencing of transposon mutants – support unbiased screens of bacterial mutants in the fly. To investigate mechanisms of host-pathogen interplay and exploit the tractability of this model host, we used a high-throughput, genome-wide mutant analysis to find genes that enable a pathogen, P. aeruginosa , to colonize the fly. Our analysis reveals critical mediators of P. aeruginosa establishment in its host, some of which are required across fly and mouse systems. These findings demonstrate the utility of massively parallel mutant analysis and provide a platform for aligning the fly toolkit with comprehensive bacterial genomics.

Bacterially produced antibiotics play important roles in microbial interactions and competition. Antibiosis can induce resistance mechanisms in target organisms and may induce other countermeasures as well. Here, we show that hygromycin A from Streptomyces sp. 2AW induces Chromobacterium violaceum ATCC31532 to produce the purple antibiotic violacein. Sublethal doses of other antibiotics that similarly target the polypeptide elongation step of translation likewise induced violacein production, unlike antibiotics with different targets. C. violaceum biofilm formation and virulence against Drosophila melanogaster were also induced by translation-inhibiting antibiotics, and we identified an antibiotic-induced response (air) two-component regulatory system that is required for these responses. Genetic analyses indicated a connection between the Air system, quorum-dependent signaling, and the negative regulator VioS, leading us to propose a model for induction of violacein production. This work suggests a novel mechanism of interspecies interaction in which a bacterium produces an antibiotic in response to inhibition by another bacterium.

The quest to manipulate microbiomes has intensified, but many microbial communities have proven recalcitrant to sustained change. Developing model communities amenable to genetic dissection will underpin successful strategies for shaping microbiomes by advancing understanding of community interactions. We developed a model community with representatives from three dominant rhizosphere taxa: the Firmicutes, Proteobacteria, and Bacteroidetes. We chose Bacillus cereus as a model rhizosphere Firmicute and characterized twenty other candidates, including hitchhikers that co-isolated with B. cereus from the rhizosphere. Pairwise analysis produced a hierarchical interstrain-competition network. We chose two hitchhikers - Pseudomonas koreensis from the top tier of the competition network and Flavobacterium johnsoniae from the bottom of the network to represent the Proteobacteria and Bacteroidetes, respectively. The model community has several emergent properties - induction of dendritic expansion of B. cereus colonies by either of the other members and production of more robust biofilms by the three members together than individually. Moreover, P. koreensis produces a novel family of alkaloid antibiotics that inhibit growth of F. johnsoniae, and production is inhibited by B. cereus. We designate this community THOR, because the members are the hitchhikers of the rhizosphere. The genetic, genomic, and biochemical tools available for dissection of THOR provide the means to achieve a new level of understanding of microbial community behavior.

The reciprocal interaction between rhizosphere bacteria and their plant hosts results in a complex battery of genetic and physiological responses. In this study, we used insertion sequencing (INSeq) to reveal the genetic determinants responsible for the fitness of Pseudomonas aeruginosa PGPR2 during root colonization. We generated a random transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa PGPR2 comprising 39,500 unique insertions and identified genes required for growth in culture and on corn roots. A total of 108 genes were identified as contributing to the fitness of strain PGPR2 on roots. The importance in root colonization of four genes identified in the TnSeq screen was verified by constructing deletion mutants in the genes and testing them for the ability to colonize corn roots singly or in competition with the wild type. All four mutants were affected in corn root colonization, displaying 5- to 100-fold reductions in populations in single inoculations, and all were outcompeted by the wild type by almost 100-fold after seven days on corn roots in mixed inoculations of the wild type and mutant. The genes identified in the screen had homology to genes involved in amino acid catabolism, stress adaptation, detoxification, signal transduction, and transport. INSeq technology proved a successful tool to identify fitness factors in P. aeruginosa PGPR2 for root colonization.

Abstract Multispecies microbial communities drive most ecosystems on Earth. Chemical and biological interactions within these communities can affect survival of individual members and the entire community. However, the prohibitively high number of possible interactions within a microbial community has made the characterization of factors that influence community development challenging. Here we report a Microbial Community Interaction (μCI) device to advance the systematic study of chemical and biological interactions within a microbial community. The μCI creates a combinatorial landscape made up of an array of triangular wells interconnected with circular wells, which each contains either a different chemical or microbial strain, generating chemical gradients and revealing biological interactions. Bacillus cereus UW85 containing GFP provided the “target” readout in the triangular wells, and antibiotics or microorganisms in adjacent circular wells are designated the “variables”. The μCI device revealed that gentamicin and vancomycin are antagonistic to each other in inhibiting the target B. cereus UW85, displaying weaker inhibitory activity when used in combination than alone. We identified three-member communities constructed with isolates from the plant rhizosphere that increased or decreased growth of B. cereus . The μCI device enables both strain-level and community-level insight. The scalable geometric design of the μCI device enables experiments with high combinatorial efficiency, thereby providing a simple, scalable platform for systematic interrogation of three-factor interactions that influence microorganisms in solitary or community life.