Lung cancer and cardiovascular disease are major causes of death in the United States. It has been proposed that carotenoids and retinoids are agents that may prevent these disorders.We conducted a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled primary prevention trial -- the Beta Carotene and Retinol Efficacy Trial -- involving a total of 18,314 smokers, former smokers, and workers exposed to asbestos. The effects of a combination of 30 mg of beta carotene per day and 25,000 IU of retinol (vitamin A) in the form of retinyl palmitate per day on the primary end point, the incidence of lung cancer, were compared with those of placebo.A total of 388 new cases of lung cancer were diagnosed during the 73,135 person-years of follow-up (mean length of follow-up, 4.0 years). The active-treatment group had a relative risk of lung cancer of 1.28 (95 percent confidence interval, 1.04 to 1.57; P=0.02), as compared with the placebo group. There were no statistically significant differences in the risks of other types of cancer. In the active-treatment group, the relative risk of death from any cause was 1.17 (95 percent confidence interval, 1.03 to 1.33); of death from lung cancer, 1.46 (95 percent confidence interval, 1.07 to 2.00); and of death from cardiovascular disease, 1.26 (95 percent confidence interval, 0.99 to 1.61). On the basis of these findings, the randomized trial was stopped 21 months earlier than planned; follow-up will continue for another 5 years.After an average of four years of supplementation, the combination of beta carotene and vitamin A had no benefit and may have had an adverse effect on the incidence of lung cancer and on the risk of death from lung cancer, cardiovascular disease, and any cause in smokers and workers exposed to asbestos.

A systematic analysis of metabolites in prostate cancer samples has led to the discovery that sarcosine, an amino acid common in many biological tissues including muscle, is highly elevated in aggressive prostate cancers and detectable in the urine of men with prostate cancer. This makes sarcosine a candidate biomarker for prostate cancer diagnosis. Targeted knockdown of the enzyme that generates sarcosine from glycine attenuated prostate cell invasion in mice, pointing to a possible role in metastasis, and adding the sarcosine pathway to the list of possible therapeutic targets. A systematic analysis of metabolites in prostate cancer samples has led to the identification of sarcosine as a putative biomarker detectable in urine, which could potentially be used to aid prostate cancer diagnosis. Sarcosine promotes the invasion of prostate cancer cells and may play a role in metastasis. Multiple, complex molecular events characterize cancer development and progression1,2. Deciphering the molecular networks that distinguish organ-confined disease from metastatic disease may lead to the identification of critical biomarkers for cancer invasion and disease aggressiveness. Although gene and protein expression have been extensively profiled in human tumours, little is known about the global metabolomic alterations that characterize neoplastic progression. Using a combination of high-throughput liquid-and-gas-chromatography-based mass spectrometry, we profiled more than 1,126 metabolites across 262 clinical samples related to prostate cancer (42 tissues and 110 each of urine and plasma). These unbiased metabolomic profiles were able to distinguish benign prostate, clinically localized prostate cancer and metastatic disease. Sarcosine, an N-methyl derivative of the amino acid glycine, was identified as a differential metabolite that was highly increased during prostate cancer progression to metastasis and can be detected non-invasively in urine. Sarcosine levels were also increased in invasive prostate cancer cell lines relative to benign prostate epithelial cells. Knockdown of glycine-N-methyl transferase, the enzyme that generates sarcosine from glycine, attenuated prostate cancer invasion. Addition of exogenous sarcosine or knockdown of the enzyme that leads to sarcosine degradation, sarcosine dehydrogenase, induced an invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Androgen receptor and the ERG gene fusion product coordinately regulate components of the sarcosine pathway. Here, by profiling the metabolomic alterations of prostate cancer progression, we reveal sarcosine as a potentially important metabolic intermediary of cancer cell invasion and aggressivity.

Background : Evidence has accumulated from observational studies that people eating more fruits and vegetables, which are rich in β-carotene (a violet to yellow plant pigment that acts as an antioxidant and can be converted to vitamin A by enzymes in the intestinal wall and liver) and retinol (an alcohol chemical form of vitamin A), and people having higher serum β-carotene concentrations had lower rates of lung cancer. The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial (CARET) tested the combination of 30 mg β-carotene and 25 000 IU retinyl palmitate (vitamin A) taken daily against placebo in 18 314 men and women at high risk of developing lung cancer. The CARET intervention was stopped 21 months early because of clear evidence of no benefit and substantial evidence of possible harm; there were 28% more lung cancers and 17% more deaths in the active intervention group (active = the daily combination of 30 mg β-carotene and 25 000 IU retinyl palmitate). Promptly after the January 18, 1996, announcement that the CARET active intervention had been stopped, we published preliminary findings from CARET regarding cancer, heart disease, and total mortality. Purpose : We present for the first time results based on the pre-specified analytic method, details about risk factors for lung cancer, and analyses of subgroups and of factors that possibly influence response to the intervention. Methods : CARET was a randomized, double-blinded, placebo-controlled chemoprevention trial, initiated with a pilot phase and then expanded 10-fold at six study centers. Cigarette smoking history and status and alcohol intake were assessed through participant self-report. Serum was collected from the participants at base line and periodically after randomization and was analyzed for β-carotene concentration. An Endpoints Review Committee evaluated endpoint reports, including pathologic review of tissue specimens. The primary analysis is a stratified logrank test for intervention arm differences in lung cancer incidence, with weighting linearly to hypothesized full effect at 24 months after randomization. Relative risks (RRs) were estimated by use of Cox regression models; tests were performed for quantitative and qualitative interactions between the intervention and smoking status or alcohol intake. O'Brien-Fleming boundaries were used for stopping criteria at interim analyses. Statistical significance was set at the.05 α value, and all P values were derived from two-sided statistical tests. Results : According to CARET's pre-specified analysis, there was an RR of 1.36 (95% confidence interval [CI] = 1.07–1.73; P =.01) for weighted lung cancer incidence for the active intervention group compared with the placebo group, and RR = 1.59 (95% CI = 1.13–2.23; P =.01) for weighted lung cancer mortality. All subgroups, except former smokers, had a point estimate of RR of 1.10 or greater for lung cancer. There are suggestions of associations of the excess lung cancer incidence with the highest quartile of alcohol intake (RR = 1.99; 95% CI = 1.28–3.09; test for heterogeneity of RR among quartiles of alcohol intake has P =.01, unadjusted for multiple comparisons) and with large-cell histology (RR = 1.89; 95% CI = 1.09–3.26; test for heterogeneity among histologic categories has P =.35), but not with base-line serum B-carotene concentrations. Conclusions : CARET participants receiving the combination of β-carotene and vitamin A had no chemopreventive benefit and had excess lung cancer incidence and mortality. The results are highly consistent with those found for β-carotene in the Alpha-Tocopherol Beta-Carotene Cancer Prevention Study in 29 133 male smokers in Finland. Implications : Individuals at high risk of developing lung cancer, i.e., current smokers and asbestos-exposed workers, should be discouraged from taking supplemental β-carotene (and the combination of β-carotene with vitamin A). Safety and efficacy should be demonstrated before recommending use of vitamin supplements in any population. [J Natl Cancer Inst 1996; 88: 1550–9]

Abstract HUPO initiated the Plasma Proteome Project (PPP) in 2002. Its pilot phase has (1) evaluated advantages and limitations of many depletion, fractionation, and MS technology platforms; (2) compared PPP reference specimens of human serum and EDTA, heparin, and citrate‐anti‐coagulated plasma; and (3) created a publicly‐available knowledge base (www.bioinformatics.med.umich.edu/hupo/ppp; www.ebi.ac.uk/pride). Thirty‐five participating laboratories in 13 countries submitted datasets. Working groups addressed (a) specimen stability and protein concentrations; (b) protein identifications from 18 MS/MS datasets; (c) independent analyses from raw MS‐MS spectra; (d) search engine performance, subproteome analyses, and biological insights; (e) antibody arrays; and (f) direct MS/SELDI analyses. MS‐MS datasets had 15 710 different International Protein Index (IPI) protein IDs; our integration algorithm applied to multiple matches of peptide sequences yielded 9504 IPI proteins identified with one or more peptides and 3020 proteins identified with two or more peptides (the Core Dataset). These proteins have been characterized with Gene Ontology, InterPro, Novartis Atlas, OMIM, and immunoassay‐based concentration determinations. The database permits examination of many other subsets, such as 1274 proteins identified with three or more peptides. Reverse protein to DNA matching identified proteins for 118 previously unidentified ORFs. We recommend use of plasma instead of serum, with EDTA (or citrate) for anticoagulation. To improve resolution, sensitivity and reproducibility of peptide identifications and protein matches, we recommend combinations of depletion, fractionation, and MS/MS technologies, with explicit criteria for evaluation of spectra, use of search algorithms, and integration of homologous protein matches. This Special Issue of PROTEOMICS presents papers integral to the collaborative analysis plus many reports of supplementary work on various aspects of the PPP workplan. These PPP results on complexity, dynamic range, incomplete sampling, false‐positive matches, and integration of diverse datasets for plasma and serum proteins lay a foundation for development and validation of circulating protein biomarkers in health and disease.

Summary

 To elucidate the deregulated functional modules that drive clear cell renal cell carcinoma (ccRCC), we performed comprehensive genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic characterization of treatment-naive ccRCC and paired normal adjacent tissue samples. Genomic analyses identified a distinct molecular subgroup associated with genomic instability. Integration of proteogenomic measurements uniquely identified protein dysregulation of cellular mechanisms impacted by genomic alterations, including oxidative phosphorylation-related metabolism, protein translation processes, and phospho-signaling modules. To assess the degree of immune infiltration in individual tumors, we identified microenvironment cell signatures that delineated four immune-based ccRCC subtypes characterized by distinct cellular pathways. This study reports a large-scale proteogenomic analysis of ccRCC to discern the functional impact of genomic alterations and provides evidence for rational treatment selection stemming from ccRCC pathobiology.

To explore the biology of lung adenocarcinoma (LUAD) and identify new therapeutic opportunities, we performed comprehensive proteogenomic characterization of 110 tumors and 101 matched normal adjacent tissues (NATs) incorporating genomics, epigenomics, deep-scale proteomics, phosphoproteomics, and acetylproteomics. Multi-omics clustering revealed four subgroups defined by key driver mutations, country, and gender. Proteomic and phosphoproteomic data illuminated biology downstream of copy number aberrations, somatic mutations, and fusions and identified therapeutic vulnerabilities associated with driver events involving KRAS, EGFR, and ALK. Immune subtyping revealed a complex landscape, reinforced the association of STK11 with immune-cold behavior, and underscored a potential immunosuppressive role of neutrophil degranulation. Smoking-associated LUADs showed correlation with other environmental exposure signatures and a field effect in NATs. Matched NATs allowed identification of differentially expressed proteins with potential diagnostic and therapeutic utility. This proteogenomics dataset represents a unique public resource for researchers and clinicians seeking to better understand and treat lung adenocarcinomas.

Medical histories of the 15,924 male twin pairs in the National Academy of Sciences‐National Research Council Twin Registry were examined to determine, within pairs, concordances for alcoholism and its medical end points. Prevalences per 1,000 among individual twin subjects were 29.6 for alcoholism, 4.1 for alcoholic psychosis, 14.2 for liver cirrhosis, and 2.1 for pancreatitis. Prevalences were similar for monozygotic (MZ) and dizygotic (DZ) twins. Prevalences in percent among co‐twins of diagnosed subjects, that is case‐wise twin concordance rates, were, respectively, by diagnosis: alcoholism: 26.3 (MZ), 11.9 (DZ); alcoholic psychosis: 21.1 (MZ), 6.0 (DZ); and liver cirrhosis: 14.6 (MZ), 5.4 (DZ). No twin pairs concordant for pancreatitis were found. The greater concordance for alcoholic psychosis and for liver cirrhosis among MZ than DZ twins could not be explained by the difference in alcoholism concordance between them. The difference in concordance between MZ and DZ twins persisted when, in addition, it was assumed that only half of the actually occurring cases of alcoholism and of each of the end points have been ascertained. These results provide evidence in favor of genetic predisposition to organ‐specific complications of alcoholism and should serve to stimulate searches for the underlying biochemical mechanisms.

Human blood plasma can be obtained relatively noninvasively and contains proteins from most, if not all, tissues of the body. Therefore, an extensive, quantitative catalog of plasma proteins is an important starting point for the discovery of disease biomarkers. In 2005, we showed that different proteomics measurements using different sample preparation and analysis techniques identify significantly different sets of proteins, and that a comprehensive plasma proteome can be compiled only by combining data from many different experiments. Applying advanced computational methods developed for the analysis and integration of very large and diverse data sets generated by tandem MS measurements of tryptic peptides, we have now compiled a high-confidence human plasma proteome reference set with well over twice the identified proteins of previous high-confidence sets. It includes a hierarchy of protein identifications at different levels of redundancy following a clearly defined scheme, which we propose as a standard that can be applied to any proteomics data set to facilitate cross-proteome analyses. Further, to aid in development of blood-based diagnostics using techniques such as selected reaction monitoring, we provide a rough estimate of protein concentrations using spectral counting. We identified 20,433 distinct peptides, from which we inferred a highly nonredundant set of 1929 protein sequences at a false discovery rate of 1%. We have made this resource available via PeptideAtlas, a large, multiorganism, publicly accessible compendium of peptides identified in tandem MS experiments conducted by laboratories around the world. Human blood plasma can be obtained relatively noninvasively and contains proteins from most, if not all, tissues of the body. Therefore, an extensive, quantitative catalog of plasma proteins is an important starting point for the discovery of disease biomarkers. In 2005, we showed that different proteomics measurements using different sample preparation and analysis techniques identify significantly different sets of proteins, and that a comprehensive plasma proteome can be compiled only by combining data from many different experiments. Applying advanced computational methods developed for the analysis and integration of very large and diverse data sets generated by tandem MS measurements of tryptic peptides, we have now compiled a high-confidence human plasma proteome reference set with well over twice the identified proteins of previous high-confidence sets. It includes a hierarchy of protein identifications at different levels of redundancy following a clearly defined scheme, which we propose as a standard that can be applied to any proteomics data set to facilitate cross-proteome analyses. Further, to aid in development of blood-based diagnostics using techniques such as selected reaction monitoring, we provide a rough estimate of protein concentrations using spectral counting. We identified 20,433 distinct peptides, from which we inferred a highly nonredundant set of 1929 protein sequences at a false discovery rate of 1%. We have made this resource available via PeptideAtlas, a large, multiorganism, publicly accessible compendium of peptides identified in tandem MS experiments conducted by laboratories around the world. Blood plasma contains a combination of subproteomes derived from different tissues, and thus, it potentially provides a window into an individual's state of health. Therefore, a detailed analysis of the plasma proteome holds promise as a source of biomarkers that can be used for the diagnosis and staging of diseases, as well as for monitoring progression and response to therapy. For many years, before the era of proteomics, the classic multivolume reference, The Plasma Proteins by Frank Putnam (1975–1989) (1Putnam F.W. The Plasma Proteins. 2nd Ed. Academic Press, New York1975–1989Google Scholar), provided a foundation for studies of plasma proteins. In 2002, Anderson and Anderson (2Anderson N.L. Anderson N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.Mol. Cell Proteomics. 2002; 1: 845-867Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3528) Google Scholar) published a review of 289 plasma proteins studied by a wide variety of methods, and quantified primarily with immunoassays, providing an early plasma proteome reference set. Subsequently, the widespread adoption of liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) 1The abbreviations used are:LC-MS/MSliquid chromatography-tandem MSHUPOHuman Proteome OrganizationPPPPlasma Proteome ProjectIPIInternational Protein IndexTPPTrans-Proteomic PipelineFDRfalse discovery ratePSMpeptide-spectrum matchSRMselected reaction monitoring. techniques resulted in a rapid increase in plasma proteome-related data sets that needed to be similarly integrated to form a next-generation comprehensive human plasma proteome reference set. In 2002, the Human Proteome Organization (HUPO) launched Phase I of its Human Plasma Proteome Project (PPP) and provided reference specimens of serum and EDTA-, citrate-, and heparin-anticoagulated plasma to 55 laboratories. Eighteen laboratories contributed tandem MS findings and protein identifications, which were integrated by a collaborative process into a core data set of 3020 proteins from the International Protein Index (IPI) database (3Kersey P.J. Duarte J. Williams A. Karavidopoulou Y. Birney E. Apweiler R. The International Protein Index: an integrated database for proteomics experiments.Proteomics. 2004; 4: 1985-1988Crossref PubMed Scopus (640) Google Scholar) containing two or more identified peptides, plus filters for smaller, higher confidence lists (4Omenn G.S. States D.J. Adamski M. Blackwell T.W. Menon R. Hermjakob H. Apweiler R. Haab B.B. Simpson R.J. Eddes J.S. Kapp E.A. Moritz R.L. Chan D.W. Rai A.J. Admon A. Aebersold R. Eng J. Hancock W.S. Hefta S.A. Meyer H. Paik Y.K. Yoo J.S. Ping P. Pounds J. Adkins J. Qian X. Wang R. Wasinger V. Wu C.Y. Zhao X. Zeng R. Archakov A. Tsugita A. Beer I. Pandey A. Pisano M. Andrews P. Tammen H. Speicher D.W. Hanash S.M. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core data set of 3020 proteins and a publicly-available database.Proteomics. 2005; 5: 3226-3245Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar, 5Omenn G. Exploring the Human Plasma Proteome. Wiley-VCH, New York, NY2006Crossref Scopus (0) Google Scholar). A stringent re-analysis of the PPP data, including adjustment for multiple comparisons, yielded 889 proteins (6States D.J. Omenn G.S. Blackwell T.W. Fermin D. Eng J. Speicher D.W. Hanash S.M. Challenges in deriving high-confidence protein identifications from data gathered by a HUPO plasma proteome collaborative study.Nat. Biotechnol. 2006; 24: 333-338Crossref PubMed Scopus (286) Google Scholar). liquid chromatography-tandem MS Human Proteome Organization Plasma Proteome Project International Protein Index Trans-Proteomic Pipeline false discovery rate peptide-spectrum match selected reaction monitoring. Meanwhile, in 2004, Anderson et al. (7Anderson N.L. Polanski M. Pieper R. Gatlin T. Tirumalai R.S. Conrads T.P. Veenstra T.D. Adkins J.N. Pounds J.G. Fagan R. Lobley A. The human plasma proteome: a nonredundant list developed by combination of four separate sources.Mol. Cell Proteomics. 2004; 3: 311-326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (749) Google Scholar) published a compilation of 1175 nonredundant plasma proteins reported in the 2002 literature review and in three published experimental data sets (8Pieper R. Gatlin C.L. Makusky A.J. Russo P.S. Schatz C.R. Miller S.S. Su Q. McGrath A.M. Estock M.A. Parmar P.P. Zhao M. Huang S.T. Zhou J. Wang F. Esquer-Blasco R. Anderson N.L. Taylor J. Steiner S. The human serum proteome: display of nearly 3700 chromatographically separated protein spots on two-dimensional electrophoresis gels and identification of 325 distinct proteins.Proteomics. 2003; 3: 1345-1364Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 9Adkins J.N. Varnum S.M. Auberry K.J. Moore R.J. Angell N.H. Smith R.D. Springer D.L. Pounds J.G. Toward a human blood serum proteome: analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry.Mol. Cell Proteomics. 2002; 1: 947-955Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (713) Google Scholar, 10Tirumalai R.S. Chan K.C. Prieto D.A. Issaq H.J. Conrads T.P. Veenstra T.D. Characterization of the low molecular weight human serum proteome.Mol. Cell Proteomics. 2003; 2: 1096-1103Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (727) Google Scholar). Only 46 were reported in all four sources, suggesting variability in the proteins detected by different methods, high false positive rates because of insufficiently stringent identification criteria, and nonuniform methods for assigning protein identifications. Shen et al. (11Shen Y. Jacobs J.M. Camp 2nd, D.G. Fang R. Moore R.J. Smith R.D. Xiao W. Davis R.W. Tompkins R.G. Ultra-high-efficiency strong cation exchange LC/RPLC/MS/MS for high dynamic range characterization of the human plasma proteome.Anal. Chem. 2004; 76: 1134-1144Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar) reported 800 to 1682 proteins from human plasma, depending on the proteolytic enzymes used and the criteria applied for identification; Omenn et al. (4Omenn G.S. States D.J. Adamski M. Blackwell T.W. Menon R. Hermjakob H. Apweiler R. Haab B.B. Simpson R.J. Eddes J.S. Kapp E.A. Moritz R.L. Chan D.W. Rai A.J. Admon A. Aebersold R. Eng J. Hancock W.S. Hefta S.A. Meyer H. Paik Y.K. Yoo J.S. Ping P. Pounds J. Adkins J. Qian X. Wang R. Wasinger V. Wu C.Y. Zhao X. Zeng R. Archakov A. Tsugita A. Beer I. Pandey A. Pisano M. Andrews P. Tammen H. Speicher D.W. Hanash S.M. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core data set of 3020 proteins and a publicly-available database.Proteomics. 2005; 5: 3226-3245Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar) re-analyzed those raw spectra with HUPO PPP-I search parameters and matched only 213 to the PPP-I core data set. Chan et al. reported 1444 unique proteins in serum using a multidimensional peptide separation strategy (12Chan K.C. Lucas D.A. Hise D. et al.Serum/Plasma Proteome.Clinical Proteomics. 2004; 1: 101-225Crossref Scopus (104) Google Scholar), of which 1019 mapped to IPI and 257 to the PPP-I core data set. These previous efforts highlight the challenges associated with accurately determining the number of proteins inferred from large proteomic data sets, and with comparing the proteins identified in different data sets. In 2005, we used a uniform method based on the Trans-Proteomic Pipeline (13Keller A. Eng J. Zhang N. Li X.J. Aebersold R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.Mol. Syst. Biol. 2005; 12005.0017Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar) to create the first Human Plasma PeptideAtlas (14Deutsch E.W. Eng J.K. Zhang H. King N.L. Nesvizhskii A.I. Lin B. Lee H. Yi E.C. Ossola R. Aebersold R. Human Plasma PeptideAtlas.Proteomics. 2005; 5: 3497-3500Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar), containing 28 LC-MS/MS data sets and over 1.9 million spectra. Using a PeptideProphet (15Keller A. Nesvizhskii A.I. Kolker E. Aebersold R. Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.Anal. Chem. 2002; 74: 5383-5392Crossref PubMed Scopus (3857) Google Scholar) probability threshold of p > = 0.90, 6929 peptides were identified at a peptide false discovery rate (FDR) of 12%, as estimated by PeptideProphet's data model, mapping to about 960 distinct proteins. Comparison of protein identifiers with those from studies cited above showed quite limited overlap. From the 2005 Human Plasma PeptideAtlas, as well as the PPP-I collaboration, we concluded that different proteomics experiments using different samples, depletion, fractionation, sample preparation, and analysis techniques identify significantly different sets of proteins. We decided that a comprehensive plasma proteome could be compiled only by combining data from many diverse, high-quality experiments, and strove to collect as much such data as possible. The resulting 2007 Human Plasma PeptideAtlas (unpublished), encompassing 53 LC-MS/MS data sets, identified 27,801 distinct peptides—four times the number in the 2005 Atlas—and 2738 proteins. In 2008, Schenk et al. (16Schenk S. Schoenhals G.J. de Souza G. Mann M. A high confidence, manually validated human blood plasma protein reference set.BMC Med. Genomics. 2008; 1: 41Crossref PubMed Google Scholar) published a high-confidence set of 697 nonimmunoglobulin human plasma proteins based on measuring a single pooled sample on two high-end MS instruments after depletion, prefractionation, and protease inhibition, with stringent validation methods. This highly nonredundant set of proteins likely contains fewer false-positives than any previous MS-derived plasma proteome reference set. The goal of the present work was to compile a larger human plasma proteome reference set of similar high confidence by creating a new release of the Human Plasma PeptideAtlas incorporating more data than in 2007 and interpreting the data using more stringent criteria. We searched raw data sets submitted to PeptideAtlas and performed peptide validation using a uniform pipeline (Fig. 1), compiled several sets of corresponding protein identifications at different clearly defined levels of redundancy (Fig. 2), and, using a spectral counting technique, provided a rough estimate of concentrations for a highly nonredundant set of protein sequences to guide blood-based diagnostic efforts such as doping using stable isotope-labeled synthetic reference peptides for selected reaction monitoring (SRM) experiments (Fig. 3). The result is a plasma proteome reference set (Fig. 4) (supplemental Tables S3 and S6) containing 1929 highly nonredundant protein sequences at an estimated 1% FDR.Fig. 2A, Six shaded bars (two of which overlap) represent sets of protein identifications at various levels of redundancy under the Cedar scheme. Tallies are for the Human Plasma PeptideAtlas. Beginning at bottom: •Exhaustive set: contains any protein sequence in the atlas' combined protein sequence database (Swiss-Prot 2010–04 + IPI v3.71 + Ensembl v57.37) that includes at least one identified peptide. •Sequence-unique set: exhaustive set with exact duplicates removed. •Peptide-set-unique set: a subset of the sequence-unique set within which no two protein sequences include the exact same set of identified peptides. •Not subsumed set: peptide-set-unique set with subsumed protein sequences removed (those for which the identified peptides form a proper subset of the identified peptides for another protein sequence). •Canonical set: a subset of the not subsumed set within which no protein sequence includes more than 80% of the peptides of any other member of the set. Protein sequences that are not subsumed, but not canonical are called possibly distinguished, because each has a peptide set that is close, but not identical, to that of a canonical protein sequence. •Covering set: a minimal set of protein sequences that can explain all of the identified peptides. B, Peptide-centric illustration of six protein sequences in a hypothetical ProteinProphet protein group, in order of descending ProteinProphet probability. Heavy lines represent protein chains (with invented identifiers); lighter lines represent observed peptides. Vertically aligned peptides are identical in sequence, and one instance of each is labeled with the letter of the highest probability protein to which it maps. A' is indistinguishable from A because it contains exactly the same set of observed peptides; both are equally likely to exist in the sample(s), but A is labeled canonical because its Swiss-Prot protein identifier is preferred. E is subsumed by A because its observed peptides form a subset of A's peptides; it is also subsumed by A', C, and D. Protein sequences B, C, and D are labeled possibly distinguished because the peptide set for each is slightly different from that of A. The three protein sequences with superscript C comprise the smallest subset of sequences sufficient to explain all the observed peptides in the group, and thus belong to the covering set.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Fig. 3Plasma protein concentrations determined using immunoassay and antibody microarray analysis (40Haab B.B. Geierstanger B.H. Michailidis G. Vitzthum F. Forrester S. Okon R. Saviranta P. Brinker A. Sorette M. Perlee L. Suresh S. Drwal G. Adkins J.N. Omenn G.S. Immunoassay and antibody microarray analysis of the HUPO Plasma Proteome Project reference specimens: systematic variation between sample types and calibration of mass spectrometry data.Proteomics. 2005; 5: 3278-3291Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar) versus normalized spectral counts from the Human Plasma Non-glyco PeptideAtlas, plotted on a log scale. Each small square represents a protein found in both sources. Hollow squares represent proteins that were excluded when drawing the trend line (either depleted (albumin) or fewer than four spectrum counts). The line segments above and below the trend line are fit to the standard deviation of the y axis values computed at intervals of 0.1 (log scale). The arrows on the left represent proteins with reported concentrations in (40Haab B.B. Geierstanger B.H. Michailidis G. Vitzthum F. Forrester S. Okon R. Saviranta P. Brinker A. Sorette M. Perlee L. Suresh S. Drwal G. Adkins J.N. Omenn G.S. Immunoassay and antibody microarray analysis of the HUPO Plasma Proteome Project reference specimens: systematic variation between sample types and calibration of mass spectrometry data.Proteomics. 2005; 5: 3278-3291Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar) but no spectrum counts. The histogram at the right depicts an estimate of the completeness of the Human Plasma Non-glyco PeptideAtlas as a function of concentration, calculated as the number of points divided by the total number of points and arrows within each decade. See supplemental Fig. S2, for N-Glyco atlas.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Fig. 4Proteins identified by each experiment. Each bar represents one of the 91 experiments, ordered as in supplemental Table S4. Height of dark bar = canonical protein sequences identified per experiment; total height (dark + light) = cumulative tally; width of bar = PSM count. See supplemental Fig. S5, for a similar graph of distinct peptides.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) We collected raw spectra from 91 high-quality LC-MS/MS data sets ((4Omenn G.S. States D.J. Adamski M. Blackwell T.W. Menon R. Hermjakob H. Apweiler R. Haab B.B. Simpson R.J. Eddes J.S. Kapp E.A. Moritz R.L. Chan D.W. Rai A.J. Admon A. Aebersold R. Eng J. Hancock W.S. Hefta S.A. Meyer H. Paik Y.K. Yoo J.S. Ping P. Pounds J. Adkins J. Qian X. Wang R. Wasinger V. Wu C.Y. Zhao X. Zeng R. Archakov A. Tsugita A. Beer I. Pandey A. Pisano M. Andrews P. Tammen H. Speicher D.W. Hanash S.M. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core data set of 3020 proteins and a publicly-available database.Proteomics. 2005; 5: 3226-3245Crossref PubMed Scopus (687) Google Scholar, 12Chan K.C. Lucas D.A. Hise D. et al.Serum/Plasma Proteome.Clinical Proteomics. 2004; 1: 101-225Crossref Scopus (104) Google Scholar, 17Qian W.J. Monroe M.E. Liu T. Jacobs J.M. Anderson G.A. Shen Y. Moore R.J. Anderson D.J. Zhang R. Calvano S.E. Lowry S.F. Xiao W. Moldawer L.L. Davis R.W. Tompkins R.G. Camp 2nd, D.G. Smith R.D. Quantitative proteome analysis of human plasma following in vivo lipopolysaccharide administration using 16O/18O labeling and the accurate mass and time tag approach.Mol. Cell Proteomics. 2005; 4: 700-709Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (158) Google Scholar, 18Whiteaker J.R. Zhang H. Eng J.K. Fang R. Piening B.D. Feng L.C. Lorentzen T.D. Schoenherr R.M. Keane J.F. Holzman T. Fitzgibbon M. Lin C. Zhang H. Cooke K. Liu T. Camp 2nd, D.G. Anderson L. Watts J. Smith R.D. McIntosh M.W. Paulovich A.G. Head-to-head comparison of serum fractionation techniques.J. Proteome Res. 2007; 6: 828-836Crossref PubMed Scopus (142) Google Scholar, 19Liu T. Qian W.J. Gritsenko M.A. Camp 2nd, D.G. Monroe M.E. Moore R.J. Smith R.D. Human plasma N-glycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction, hydrazide chemistry, and mass spectrometry.J. Proteome Res. 2005; 4: 2070-2080Crossref PubMed Scopus (372) Google Scholar, 20Liu T. Qian W.J. Gritsenko M.A. Xiao W. Moldawer L.L. Kaushal A. Monroe M.E. Varnum S.M. Moore R.J. Purvine S.O. Maier R.V. Davis R.W. Tompkins R.G. Camp 2nd, D.G. Smith R.D. High dynamic range characterization of the trauma patient plasma proteome.Mol. Cell Proteomics. 2006; 5: 1899-1913Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar, 21Armandola E.A. Proteome profiling in body fluids and in cancer cell signaling.Med. Gen. Med. 2003; 5: 18PubMed Google Scholar) and several unpublished; supplemental Table S4, Supplemental Data), including 44 from Phase I PPP experiments, 13 from PPP Phase II, the Chan data set, and several from corporate research laboratories. Data from both plasma and serum samples, a variety of sample preparation techniques (depleted/not depleted, various fractionation schemata, use of protease inhibitors, N-linked glycocapture enrichment (22Zhang H. Yi E.C. Li X.J. Mallick P. Kelly-Spratt K.S. Masselon C.D. Camp 3rd, D.G. Smith R.D. Kemp C.J. Aebersold R. High Throughput Quantitative Analysis of Serum Proteins Using Glycopeptide Capture and Liquid Chromatography Mass Spectrometry.Mol. Cell. Proteomics. 2005; 4: 144-155Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (189) Google Scholar)), and analysis on a variety of instruments were included. All samples were digested with trypsin. Each data set consisted of between one and 38,252 LC-MS/MS runs (median 22) for a total of 48,789 LC-MS/MS runs 2This total includes two extraordinarily large experiments together comprising 45,160 runs.. For analysis, we separated the data sets into two groups, glycocapture and nonglycocapture, and later combined the results. The 69 data sets for the nonglycocapture samples were all selected from ion trap experiments because we wished to search them against an ion trap spectral library. Data were converted to mzXML (23Pedrioli P.G. Eng J.K. Hubley R. Vogelzang M. Deutsch E.W. Raught B. Pratt B. Nilsson E. Angeletti R.H. Apweiler R. Cheung K. Costello C.E. Hermjakob H. Huang S. Julian R.K. Kapp E. McComb M.E. Oliver S.G. Omenn G. Paton N.W. Simpson R. Smith R. Taylor C.F. Zhu W. Aebersold R. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.Nat. Biotechnol. 2004; 22: 1459-1466Crossref PubMed Scopus (649) Google Scholar) and searched with SpectraST version 4.0 (24Lam H. Deutsch E.W. Eddes J.S. Eng J.K. King N. Stein S.E. Aebersold R. Development and validation of a spectral library searching method for peptide identification from MS/MS.Proteomics. 2007; 7: 655-667Crossref PubMed Scopus (387) Google Scholar) against a spectral library consisting of the NIST 3.0 human spectral library (261,777 consensus spectra) (25NIST Peptide Mass Spectral Libraries http://peptide.nist.govGoogle Scholar) plus one SpectraST-generated (26Lam H. Deutsch E.W. Aebersold R. Artificial decoy spectral libraries for false discovery rate estimation in spectral library searching in proteomics.J. Proteome Res. 2010; 9: 605-610Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar) decoy for each NIST spectrum. This library contains consensus spectra derived from actual identified spectra, some of which include missed cleavages and/or modifications. A precursor mass tolerance of 3.0 Th (thomson) was used. See supplemental Data for complete SpectraST parameters. The search results for each experiment were processed using the Trans-Proteomic Pipeline (TPP) (13Keller A. Eng J. Zhang N. Li X.J. Aebersold R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.Mol. Syst. Biol. 2005; 12005.0017Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar), as shown in Fig. 1, left (see supplemental Data for TPP parameters used). PeptideProphet (15Keller A. Nesvizhskii A.I. Kolker E. Aebersold R. Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.Anal. Chem. 2002; 74: 5383-5392Crossref PubMed Scopus (3857) Google Scholar) computed a probability for each peptide-spectrum match (PSM) for peptides of length seven or greater. iProphet (27Shteynberg, D., Deutsch, E., Lam, H., Eng, J., Sun, Z., Tasman, N., Mendoza, L., Moritz, R. L., Aebersold, R., Nesvizhskii, A. I., (submitted) iProphet: Improved statistical validation of peptide identifications in shotgun proteomics. Mol. Cell ProteomicsGoogle Scholar) was applied to the PeptideProphet results to improve discrimination by modeling five additional properties of the data beyond those modeled by PeptideProphet, and adjusting peptide probabilities accordingly. The five models are number of sibling searches (rewards or penalizes identifications based on the output of multiple search engines, not applicable here), number of replicate spectra (models the assumption that precursor ions with multiple high probability identifications are more likely to be correct), number of sibling experiments (models the assumption that precursor ions observed in multiple experiments and matched to the same peptide sequence are more likely to be correct), number of sibling ions (rewards peptides identified by precursors with different charges), and number of sibling modifications (rewards peptides identified with different mass modifications). RefreshParser mapped each PSM to a combined protein sequence database derived from Swiss-Prot 2010–04 including splice variants (28Boutet E. Lieberherr D. Tognolli M. Schneider M. Bairoch A. UniProtKB/Swiss-Prot.Methods Mol. Biol. 2007; 406: 89-112PubMed Google Scholar, 29Boeckmann B. Bairoch A. Apweiler R. Blatter M.C. Estreicher A. Gasteiger E. Martin M.J. Michoud K. O'Donovan C. Phan I. Pilbout S. Schneider M. The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003.Nucleic Acids Res. 2003; 31: 365-370Crossref PubMed Scopus (2745) Google Scholar), IPI v3.71, Ensembl v57.37 (30Hubbard T.J. Aken B.L. Ayling S. Ballester B. Beal K. Bragin E. Brent S. Chen Y. Clapham P. Clarke L. Coates G. Fairley S. Fitzgerald S. Fernandez-Banet J. Gordon L. Graf S. Haider S. Hammond M. Holland R. Howe K. Jenkinson A. Johnson N. Kahari A. Keefe D. Keenan S. Kinsella R. Kokocinski F. Kulesha E. Lawson D. Longden I. Megy K. Meidl P. Overduin B. Parker A. Pritchard B. Rios D. Schuster M. Slater G. Smedley D. Spooner W. Spudich G. Trevanion S. Vilella A. Vogel J. White S. Wilder S. Zadissa A. Birney E. Cunningham F. Curwen V. Durbin R. Fernandez-Suarez X.M. Herrero J. Kasprzyk A. Proctor G. Smith J. Searle S. Flicek P. Ensembl 2009.Nucleic Acids Res. 2009; 37: D690-697Crossref PubMed Scopus (689) Google Scholar), and cRAP v1.0 (31cRAP, Common Repository of Adventitious Proteins.http://www.thegpm.org/cRAPGoogle Scholar). In many cases, the exact same protein sequence is included in the combined database multiple times because it is contained in multiple databases and/or because the Ensembl database includes many duplicates. Each PSM was mapped to all protein sequences containing the PSM's peptide sequence; in many cases this resulted in a PSM mapping to multiple protein sequences that are duplicates, splice variants, or paralogs. For very large data sets, the FDR at the peptide level tends to be much larger than that at the PSM level, and, at the protein level, much larger still (32Reiter L. Claassen M. Schrimpf S.P. Jovanovic M. Schmidt A. Buhmann J.M. Hengartner M.O. Aebersold R. Protein identification false discovery rates for very large proteomics data sets generated by tandem mass spectrometry.Mol. Cell Proteomics. 2009; 8: 2405-2417Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (251) Google Scholar). Thus, in order to obtain a 1% decoy-estimated protein FDR for the final Human Plasma PeptideAtlas, a stringent PeptideProphet-estimated PSM FDR filter of 0.0002 (corresponding to probability cutoffs ranging from 0.9903 to 0.9998) was applied to each experiment. ProteinProphet (33Nesvizhskii A.I. Keller A. Kolker E. Aebersold R. A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.Anal. Chem. 2003; 75: 4646-4658Crossref PubMed Scopus (3589) Google Scholar) was then run on each experiment, assigning to each distinct peptide the probability of its highest probability PSM, and further adjusting these probabilities using a number of sibling peptides model, which rewards peptides that map to proteins with many identified peptides. The set of identified peptides for the HsSerum NCI Large Survey experiment (12Chan K.C. Lucas D.A. Hise D. et al.Serum/Plasma Proteome.Clinical Proteomics. 2004; 1: 101-225Crossref Scopus (104) Google Scholar) was found to contain many pep

Background: The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial (CARET) tested the effect of daily β-carotene (30 mg) and retinyl palmitate (25 000 IU) on the incidence of lung cancer, other cancers, and death in 18 314 participants who were at high risk for lung cancer because of a history of smoking or asbestos exposure. CARET was stopped ahead of schedule in January 1996 because participants who were randomly assigned to receive the active intervention were found to have a 28% increase in incidence of lung cancer, a 17% increase in incidence of death and a higher rate of cardiovascular disease mortality compared with participants in the placebo group. Methods: After the intervention ended, CARET participants returned the study vitamins to their study center and provided a final blood sample. They continue to be followed annually by telephone and mail self-report. Self-reported cancer endpoints were confirmed by review of pathology reports, and death endpoints were confirmed by review of death certificates. All statistical tests were two-sided. Results: With follow-up through December 31, 2001, the post-intervention relative risks of lung cancer and all-cause mortality for the active intervention group compared with the placebo group were 1.12 (95% confidence interval [CI] = 0.97 to 1.31) and 1.08 (95% CI = 0.99 to 1.17), respectively. Smoothed relative risk curves for lung cancer incidence and all-cause mortality indicated that relative risks remained above 1.0 throughout the post-intervention follow-up. By contrast, the relative risk of cardiovascular disease mortality decreased rapidly to 1.0 after the intervention was stopped. During the post-intervention phase, females had larger relative risks of lung cancer mortality (1.33 versus 1.14; P = .36), cardiovascular disease mortality (1.44 versus 0.93; P = .03), and all-cause mortality (1.37 versus 0.98; P = .001) than males. Conclusions: The previously reported adverse effects of β-carotene and retinyl palmitate on lung cancer incidence and all-cause mortality in cigarette smokers and individuals with occupational exposure to asbestos persisted after drug administration was stopped although they are no longer statistically significant. Planned subgroup analyses suggest that the excess risks of lung cancer were restricted primarily to females, and cardiovascular disease mortality primarily to females and to former smokers.