Although regeneration of damaged axons in peripheral nerves has long been observed, the mechanisms facilitating this growth are not well characterized. Recently, we demonstrated that host axon regeneration could be greatly enhanced by transplanting engineered living axon tracts to guide outgrowth. Here, we used a model of rat sciatic nerve transection to explore potential mechanisms of this facilitated regeneration and its efficacy in comparison with nerve guidance tubes (NGTs) and autografts. Tissue engineered nerve grafts (TENGs) were developed via 'stretch-growth' in mechanobioreactors and consisted of centimeter-scale aligned axonal tracts. Either TENGs, NGTs or autografts (reversed nerve) were then transplanted to bridge a 1 cm segmental gap in the sciatic nerve with the mechanisms of axonal regrowth assessed at 2 weeks and the extent of functional recovery assessed at 16 weeks. We observed numerous host axons growing directly along and intertwining with pre-formed axonal tracts in TENGs. This behavior appears to mimic the action of 'pioneer' axons in developmental pathfinding by providing living cues for directed and accelerated outgrowth. Indeed, we found that the rates of axon regeneration were 3-4 fold faster than NGTs and equivalent to autografts. It was also observed that infiltration of host Schwann cells − traditional drivers of peripheral axon regeneration − was both accelerated and progressed directly along TENG axonal tracts. These TENG repairs resulted in levels of functional recovery equivalent to autografts, with each being several fold superior to NGT repairs. This new mechanism − which we term ″axon-facilitated axon-regeneration″ − may be further exploited to enhance axonal regeneration and functional recovery following neurotrauma.

Achievements in intracortical brain-machine interfaces are compromised by limitations in long-term performance and information transfer rate. A biological intermediary between devices and the brain based on synaptic integration may offer a specificity and permanence that has eluded neural interfaces to date. Accordingly, we have developed the first living electrodes comprised of implantable axonal tracts protected within soft hydrogel cylinders to enable biologically-mediated monitoring and modulation of brain activity. Here we demonstrate the controlled fabrication, rapid axonal outgrowth, reproducible cytoarchitecture, and axonal conduction of these engineered constructs in vitro. We also present simultaneous optical stimulation and recording of neuronal activity in vitro, transplantation in rat cortex, and their survival, integration, and activity over time in vivo as a proof-of-concept for this neural interface paradigm. The creation and functional validation of living electrodes is a critical step towards developing a new class of neural interfaces using targeted, synaptic-based integration with native circuitry.

Muscle tissue has been exploited as a living biopotential amplifier to facilitate transduction of peripheral nerve signals into prosthetic control in patients with limb amputation. Here we sought to address the question of whether microscopically small volumes of muscle tissue could effectively broadcast field potentials to electrodes not immediately in contact with that tissue. Cardiac myocytes were grown as three-dimensional aggregates containing 105 cells comprising a volume of approximately 0.065 mm3 (~500 μm in diameter) atop multi-electrode arrays. In addition to the expected spontaneous contraction potentials detected using electrodes in direct contact with the myocytes, potentials could also be detected on distant electrodes not contacting the aggregates. Specifically, while both dissociated and aggregated cardiac myocyte cultures generated spontaneous contractions that could easily be recorded from underlying multi-electrode arrays, only aggregated myocyte cultures generated signals detectable several millimeters away by the electrode grid floating in media. This confirmed the ability of micro-volumes of aggregated muscle tissue to broadcast readily detectible signals. The amplitude of the potentials generated by the aggregates decreased exponentially with distance. The aggregates were sensitive to pharmacologic modification with isoproterenol increasing contraction rate. Simultaneous recordings with electrodes in physical contact to the aggregate and with electrodes several millimeters away revealed that the aggregates function as amplifiers and low-pass filters. This study lays the groundwork for forging myocyte aggregates as 'living amplifiers' for long-term neural recording in brain-computer interfaces to treat neurological disease and injury.

Reestablishing cerebral connectivity is a critical part of restoring neuronal network integrity and brain function after trauma, stroke, and neurodegenerative diseases. Creating transplantable axon tracts in the laboratory is a novel strategy for overcoming the common barriers limiting axon regeneration in vivo, including growth-inhibiting factors and the limited outgrowth capacity of mature neurons in the brain. We describe the generation and phenotype of three-dimensional human axon tracts derived from cerebral organoid tissue. These centimeter-long constructs are encased in an agarose shell that permits physical manipulation and are composed of discrete cellular regions spanned by axon tracts and dendrites, mirroring the separation of grey and white matter in the brain. Features of cerebral cortex also are emulated, as evidenced by the presence of neurons with different cortical layer phenotypes. This engineered neural tissue has the translational potential to reconstruct brain circuits by physically replacing discrete cortical neuron populations as well as long-range axon tracts in the brain.

The central feature of peripheral motor axons is their remarkable lengths as they project from a motor neuron residing in the spinal cord to an often-distant target muscle. However, to date in vitro models have not replicated this central feature owing to challenges in generating motor axon tracts beyond a few millimeters in length. To address this, we have developed a novel combination of micro-tissue engineering and mechanically assisted growth techniques to create long-projecting centimeter-scale motor axon tracts. Here, primary motor neurons were isolated from the spinal cords of rats and induced to form engineered micro-spheres via forced aggregation in custom micro-wells. This three-dimensional micro-tissue yielded healthy motor neurons projecting dense, fasciculated axonal tracts. Within our custom-built mechanobioreactors, motor neuron culture conditions, neuronal/axonal architecture, and mechanical growth conditions were systematically optimized to generate parameters for robust and efficient stretch-growth of motor axons. We found that axons projecting from motor neuron aggregates were able to respond to axon displacement rates at least 10 times greater than that tolerated by axons projecting from dissociated motor neurons. The growth and structural characteristics of these stretch-grown motor axons were compared to benchmark stretch-grown axons from sensory dorsal root ganglion neurons, revealing similar axon densities yet increased motor axon fasciculation. Finally, motor axons were integrated with myocytes and then stretch-grown to create novel long-projecting axonal-myocyte constructs that better recreate characteristic dimensions of native nerve-muscle anatomy. This is the first demonstration of mechanical elongation of spinal cord motor axons and may have applications as anatomically inspired in vitro testbeds or as tissue engineered living scaffolds for targeted axon tract reconstruction following nervous system injury or disease.