Abstract Approximately 20 million Americans currently experience residual deficits from traumatic peripheral nerve injury. Despite recent advancements in surgical technique, peripheral nerve repair typically results in poor functional outcomes due to prolonged periods of denervation resulting from long regenerative distances coupled with relatively slow rates of axonal regeneration. Development of novel surgical solutions requires valid preclinical models that adequately replicate the key challenges of clinical peripheral nerve injury. Our team has developed a porcine model using Yucatan minipigs that provides an opportunity to investigate peripheral nerve regeneration using different nerves tailored for a specific mechanism of interest, such as (1) nerve modality: motor, sensory, and mixed-modality; (2) injury length: short versus long gap; and (3) total regenerative distance: proximal versus distal injury. Here, we describe a comprehensive porcine model of two challenging clinically relevant procedures for repair of long segmental lesions (≥ 5 cm) – the deep peroneal nerve repaired using a sural nerve autograft and the common peroneal nerve repaired using a saphenous nerve autograft – each featuring ultra-long total regenerative distances (up to 20 cm and 27 cm, respectively) to reach distal targets. This paper includes a detailed characterization of the relevant anatomy, surgical approach/technique, functional/electrophysiological outcomes, and nerve morphometry for baseline and autograft repaired nerves. These porcine models of major peripheral nerve injury are suitable as preclinical, translatable models for evaluating the efficacy, safety, and tolerability of next-generation artificial nerve grafts prior to clinical deployment.

Abstract Peripheral nerve injury (PNI) impacts millions annually, often leaving debilitated patients with minimal repair options to improve functional recovery. Our group has previously developed tissue engineered nerve grafts (TENGs) featuring long, aligned axonal tracts from dorsal root ganglia (DRG) neurons that are fabricated in custom bioreactors using the process of axon “stretch-growth”. We have shown that TENGs effectively serve as “living scaffolds” to promote regeneration across segmental nerve defects by exploiting the newfound mechanism of axon-facilitated axon regeneration, or “AFAR”, by simultaneously providing haptic and neurotrophic support. To extend this work, the current study investigated the efficacy of living versus non-living regenerative scaffolds in preserving host sensory and motor neuronal health following nerve repair. Rats were assigned across five groups: naïve, or repair using autograft, nerve guidance tube (NGT) with collagen, NGT + non-aligned DRG populations in collagen, or TENGs. We found that TENG repairs yielded equivalent regenerative capacity as autograft repairs based on preserved health of host spinal cord motor neurons and acute axonal regeneration, whereas NGT repairs or DRG neurons within an NGT exhibited reduced motor neuron preservation and diminished regenerative capacity. These acute regenerative benefits ultimately resulted in enhanced levels of functional recovery in animals receiving TENGs, at levels matching those attained by autografts. Our findings indicate that TENGs may preserve host spinal cord motor neuron health and regenerative capacity without sacrificing an otherwise uninjured nerve (as in the case of the autograft), and therefore represent a promising alternative strategy for neurosurgical repair following PNI. HIGHLIGHTS TENGs preserve host spinal cord motor neuron health and regenerative capacity acutely following repair of segmental nerve defects, matching that of the clinical gold-standard autograft and exceeding commercially-available nerve guidance tubes. TENGs facilitated regeneration across segmental nerve defects, yielding similar degree of chronically surviving host spinal motor neurons and functional recovery as compared to autografts. Early surgical intervention for segmental nerve defect with living scaffolds, such as TENGs and autografts, preserves the host regenerative capacity, and likely increases the ceiling for total regeneration and functional recovery at chronic time points compared to (acellular) commercially-available nerve guidance tubes. TENGs preserve host neuronal health and regenerative capacity without sacrificing an otherwise uninjured nerve, and therefore represent a promising alternative strategy to autografts or nerve guidance tube repairs.

Volumetric Muscle Loss (VML) is defined as traumatic or surgical loss of skeletal muscle tissue beyond the inherent regenerative capacity of the body, generally leading to a severe functional deficit. Autologous muscle grafts remain the prevalent method of treatment whereas recent muscle repair techniques using biomaterials and tissue engineering are still at a nascent stage and have multiple challenges to address to ensure functional recovery of the injured muscle. Indeed, appropriate somato-motor innervations remain one of the biggest challenges for both autologous muscle grafts as well as tissue engineered muscle constructs. We aim to address this challenge by developing Pre-Innervated Tissue Engineered Muscle comprised of long aligned networks of spinal motor neurons and skeletal myocytes. Here, we developed methodology to biofabricate long fibrils of pre-innervated tissue engineered muscle using a co-culture of myocytes and motor neurons on aligned nanofibrous scaffolds. Motor neurons lead to enhanced differentiation and maturation of skeletal myocytes in vitro. These pre-innervated tissue engineered muscle constructs when implanted in vivo in a rat VML model significantly increase satellite cell migration, micro-vessel formation, and neuromuscular junction density in the host muscle near the injury area at an acute time point as compared to non-pre-innervated myocyte constructs and nanofiber scaffolds alone. These pro-regenerative effects can potentially lead to enhanced functional neuromuscular regeneration following VML, thereby improving the levels of functional recovery following these devastating injuries.

Although regeneration of damaged axons in peripheral nerves has long been observed, the mechanisms facilitating this growth are not well characterized. Recently, we demonstrated that host axon regeneration could be greatly enhanced by transplanting engineered living axon tracts to guide outgrowth. Here, we used a model of rat sciatic nerve transection to explore potential mechanisms of this facilitated regeneration and its efficacy in comparison with nerve guidance tubes (NGTs) and autografts. Tissue engineered nerve grafts (TENGs) were developed via 'stretch-growth' in mechanobioreactors and consisted of centimeter-scale aligned axonal tracts. Either TENGs, NGTs or autografts (reversed nerve) were then transplanted to bridge a 1 cm segmental gap in the sciatic nerve with the mechanisms of axonal regrowth assessed at 2 weeks and the extent of functional recovery assessed at 16 weeks. We observed numerous host axons growing directly along and intertwining with pre-formed axonal tracts in TENGs. This behavior appears to mimic the action of 'pioneer' axons in developmental pathfinding by providing living cues for directed and accelerated outgrowth. Indeed, we found that the rates of axon regeneration were 3-4 fold faster than NGTs and equivalent to autografts. It was also observed that infiltration of host Schwann cells − traditional drivers of peripheral axon regeneration − was both accelerated and progressed directly along TENG axonal tracts. These TENG repairs resulted in levels of functional recovery equivalent to autografts, with each being several fold superior to NGT repairs. This new mechanism − which we term ″axon-facilitated axon-regeneration″ − may be further exploited to enhance axonal regeneration and functional recovery following neurotrauma.

Promising biomaterials for facilitating regeneration should be tested in appropriate large animal models that better recapitulate human inflammatory and regenerative responses than rodent models. Previous studies have shown tyrosine-derived polycarbonates (TyrPC) are versatile biomaterials with a wide range of tissue engineering applications across multiple disciplines. The library of TyrPC has been well studied and consists of thousands of polymer compositions with tunable mechanical characteristics and degradation and resorption rates that are useful for the design of nerve guidance tubes (NGTs). NGTs made of different TyrPCs have been used in segmental nerve defect models in small animals. The current study is an extension of this work and evaluates the effects of NGTs made using two different TyrPC compositions in a porcine model of peripheral nerve injury and repair. We first evaluated a nondegradable TyrPC formulation in a 1 cm segmental nerve defect model in pigs, demonstrating proof-of-concept of chronic regenerative efficacy up to 6 months, at which time nerve/muscle electrophysiology and nerve morphometry were similar to those attained by an autograft repair control. Next, we characterized the acute regenerative response to a degradable TyrPC formulation using the same 1 cm segmental defect model. After 2 weeks in vivo, this TyrPC NGT was found to promote the deposition by host cells of pro-regenerative extracellular matrix (ECM) constituents (in particular collagen I, collagen III, collagen IV, laminin and fibronectin) at levels exceeding those deposited inside commercially available collagen-based NGTs. This corresponded with dense and rapid infiltration of host Schwann cells and axons into the lumen of the NGT and axonal crossing of the lesion into the distal nerve segment. These findings confirmed results reported previously in a mouse model and reveal that TyrPC NGTs were well tolerated in swine and facilitated host axon regeneration and Schwann cell infiltration in the acute phase across segmental defects - likely by eliciting a favorable neurotrophic ECM milieu. This regenerative response ultimately can contribute to functional recovery.