Melanomas are highly heterogeneous tumors, but the biological significance of their different subpopulations is not clear. Using the H3K4 demethylase JARID1B (KDM5B/PLU-1/RBP2-H1) as a biomarker, we have characterized a small subpopulation of slow-cycling melanoma cells that cycle with doubling times of >4 weeks within the rapidly proliferating main population. Isolated JARID1B-positive melanoma cells give rise to a highly proliferative progeny. Knockdown of JARID1B leads to an initial acceleration of tumor growth followed by exhaustion which suggests that the JARID1B-positive subpopulation is essential for continuous tumor growth. Expression of JARID1B is dynamically regulated and does not follow a hierarchical cancer stem cell model because JARID1B-negative cells can become positive and even single melanoma cells irrespective of selection are tumorigenic. These results suggest a new understanding of melanoma heterogeneity with tumor maintenance as a dynamic process mediated by a temporarily distinct subpopulation.

Targeting multiple components of the MAPK pathway can prolong the survival of patients with BRAFV600E melanoma. This approach is not curative, as some BRAF-mutated melanoma cells are intrinsically resistant to MAPK inhibitors (MAPKi). At the systemic level, our knowledge of how signaling pathways underlie drug resistance needs to be further expanded. Here, we have shown that intrinsically resistant BRAF-mutated melanoma cells with a low basal level of mitochondrial biogenesis depend on this process to survive MAPKi. Intrinsically resistant cells exploited an integrated stress response, exhibited an increase in mitochondrial DNA content, and required oxidative phosphorylation to meet their bioenergetic needs. We determined that intrinsically resistant cells rely on the genes encoding TFAM, which controls mitochondrial genome replication and transcription, and TRAP1, which regulates mitochondrial protein folding. Therefore, we targeted mitochondrial biogenesis with a mitochondrium-targeted, small-molecule HSP90 inhibitor (Gamitrinib), which eradicated intrinsically resistant cells and augmented the efficacy of MAPKi by inducing mitochondrial dysfunction and inhibiting tumor bioenergetics. A subset of tumor biopsies from patients with disease progression despite MAPKi treatment showed increased mitochondrial biogenesis and tumor bioenergetics. A subset of acquired drug-resistant melanoma cell lines was sensitive to Gamitrinib. Our study establishes mitochondrial biogenesis, coupled with aberrant tumor bioenergetics, as a potential therapy escape mechanism and paves the way for a rationale-based combinatorial strategy to improve the efficacy of MAPKi.

The tumor microenvironment (TME) plays a major role in the pathogenesis of multiple cancer types, including upper-gastrointestinal (GI) cancers that currently lack effective therapeutic options. Cancer-associated fibroblasts (CAF) are an essential component of the TME, contributing to tumorigenesis by secreting growth factors, modifying the extracellular matrix, supporting angiogenesis, and suppressing antitumor immune responses. Through an unbiased approach, we have established that IL-6 mediates cross-talk between tumor cells and CAF not only by supporting tumor cell growth, but also by promoting fibroblast activation. As a result, IL-6 receptor (IL6Rα) and downstream effectors offer opportunities for targeted therapy in upper-GI cancers. IL-6 loss suppressed tumorigenesis in physiologically relevant three-dimensional (3D) organotypic and 3D tumoroid models and murine models of esophageal cancer. Tocilizumab, an anti-IL6Rα antibody, suppressed tumor growth in vivo in part via inhibition of STAT3 and MEK/ERK signaling. Analysis of a pan-cancer TCGA dataset revealed an inverse correlation between IL-6 and IL6Rα overexpression and patient survival. Therefore, we expanded evaluation of tocilizumab to head and neck squamous cell carcinoma patient-derived xenografts and gastric adenocarcinoma xenografts, demonstrating suppression of tumor growth and altered STAT3 and ERK1/2 gene signatures. We used small-molecule inhibitors of STAT3 and MEK1/2 signaling to suppress tumorigenesis in the 3D organotypic model of esophageal cancer. We demonstrate that IL6 is a major contributor to the dynamic cross-talk between tumor cells and CAF in the TME. Our findings provide a translational rationale for inhibition of IL6Rα and downstream signaling pathways as a novel targeted therapy in oral-upper-GI cancers.Significance: These findings demonstrate the interaction of esophageal cancer and cancer-associated fibroblasts through IL-6 signaling, providing rationale for a novel therapeutic approach to target these cancers. Cancer Res; 78(17); 4957-70. ©2018 AACR.

Abstract Better management of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) requires a clearer understanding of tumor biology and disease risk. Bitter taste receptors (T2Rs) have been studied in several cancers, including thyroid, salivary, and GI, but their role in HNSCC has not been explored. We found that HNSCC patient samples and cell lines expressed functional T2Rs on both the cell and nuclear membranes. Bitter compounds, including bacterial metabolites, activated T2R-mediated nuclear Ca 2+ responses leading to mitochondrial depolarization, caspase activation and ultimately apoptosis. Buffering nuclear Ca 2+ elevation blocked caspase activation. Furthermore, increased expression of T2Rs in HNSCCs from The Cancer Genome Atlas (TCGA) is associated with improved overall survival. This work suggests that T2Rs are potential biomarkers to predict outcomes and guide treatment selection, may be leveraged as therapeutic targets to stimulate tumor apoptosis, and may mediate tumor-microbiome crosstalk in HNSCC.

HPV + oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPC) incidence recently surpassed cervical cancer and is the most common HPV-related cancer in the developed world. HPV16 is in ∼90 % of HPV + OPCs, with episomal genomes in the majority of cases. Most existing HPV16+ cancer cell lines derive from outside the oropharynx and harbor integrated HPV genomes. Thus, there is need for OPC preclinical models to evaluate standard and experimental therapeutics in the presence of episomal HPV16 oncogenic drivers. Here we characterize HPV genome structures in eight HPV16+ OPC patient-derived xenografts (PDXs), and evaluate their responses to standard chemotherapy. HPV genome state was investigated by combining Southern blot, T5 exonuclease assay, whole genome sequencing, and RNAseq data. This analysis revealed complexity and variation in integrated vs. episomal HPV forms across PDXs and demonstrated that four PDXs predominantly contain episomal HPV16. Episomal status did not ensure favorable in vivo responses to cisplatin therapy, despite the more favorable prognosis previously attributed to episomal HPV + tumors; this could be due to the small number present in the dataset. Our analysis establishes PDX models as test platforms for novel therapies designed to target maintenance of the episomal forms of HPV16 that commonly appear in OPC.

Abstract Persistent human papillomavirus (HPV) infection of stratified squamous epithelial cells causes nearly five percent of cancer cases worldwide. HPV-positive oropharyngeal cancers harbor few mutations in the Hippo signaling pathway compared to HPV-negative cancers at the same anatomical site, prompting the hypothesis that an HPV-encoded protein inactivates the Hippo pathway and activates the Hippo effector YAP1. The HPV E7 oncoprotein is required for HPV infection and for HPV-mediated oncogenic transformation. We investigated the effects of HPV oncoproteins on YAP1 and found that E7 activates YAP1, promoting YAP1 nuclear localization in basal epithelial cells. YAP1 activation by HPV E7 required that E7 bind and degrade the tumor suppressor PTPN14. E7 required YAP1 transcriptional activity to extend the lifespan of primary keratinocytes, indicating that YAP1 activation contributes to E7 carcinogenic activity. Maintaining infection in basal cells is critical for HPV persistence, and here we demonstrate that YAP1 activation causes HPV E7 expressing cells to be retained in the basal compartment of stratified epithelia. We propose that YAP1 activation resulting from PTPN14 inactivation is an essential, targetable activity of the HPV E7 oncoprotein relevant to HPV infection and carcinogenesis.

Abstract Human papillomaviruses (HPV) are causative agents in ano-genital and oral cancers; HPV16 is the most prevalent type detected in human cancers. The HPV16 E6 protein targets p53 for proteasomal degradation to facilitate proliferation of the HPV16 infected cell. However, in HPV16 immortalized cells E6 is predominantly spliced (E6*) and unable to degrade p53. Here we demonstrate that human foreskin keratinocytes immortalized by HPV16 (HFK+HPV16), and HPV16 positive oropharyngeal cancers, retain significant expression of p53. In addition, p53 levels can be increased in HPV16+ head and neck cancer cell lines following treatment with cisplatin. Introduction of full-length E6 into HFK+HPV16 resulted in attenuation of cellular growth (in hTERT immortalized HFK, E6 expression promoted enhanced proliferation). An understudied interaction is that between E2 and p53 and we investigated whether this was important for the viral life cycle. We generated mutant genomes with E2 unable to interact with p53 resulting in profound phenotypes in primary HFK. The mutant induced hyper-proliferation, but an ultimate arrest of cell growth; β-galactosidase staining demonstrated increased senescence, and COMET assays showed increased DNA damage compared with HFK+HPV16 wild type cells. There was failure of the viral life cycle in organotypic rafts with the mutant HFK resulting in premature differentiation and reduced proliferation. The results indicate that the E2-p53 interaction is critical during the HPV16 life cycle, and that disruption of this interaction has anti-viral potential. We discuss potential mechanisms to explain these phenotypes. Importance Human papillomaviruses are causative agents in around 5% of all cancers. There are currently no antivirals available to combat these infections and cancers, therefore it remains a priority to enhance our understanding of the HPV life cycle. Here we demonstrate that an interaction between the viral replication/transcription/segregation factor E2 and the tumor suppressor p53 is critical for the HPV16 life cycle. HPV16 immortalized cells retain significant expression of p53, and the critical role for the E2-p53 interaction demonstrates why this is the case. If the E2-p53 interaction is disrupted then HPV16 immortalized cells fail to proliferate, have enhanced DNA damage and senescence, and there is premature differentiation during the viral life cycle. Results suggest that targeting the E2-p53 interaction would have therapeutic benefits, potentially attenuating the spread of HPV16.

Therapeutic innovation for human papilloma virus-related (HPV+) head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) is impaired by inadequate biomarkers and preclinical models. This study addressed both limitations using the largest panel of HPV+ HNSCC patient-derived xenografts (PDXs) and organoids described to date. Whole exome profiles of the PDXs were compared to those of HPV+ human tumors and cell lines, and genetic features of the models were analyzed relative to their growth properties and outcomes of their patients of origin. PDX engraftment enriched for negatively prognostic NOTCH1 mutations while preserving multiple features lost in existing cell lines, including PIK3CA mutations, TRAF3 deletion, and absence of EGFR amplification. Observation of more mutations in faster-growing models facilitated identification of an association between mutational burden and local progression in both HPV+ and HPV-HNSCCs. Reduced E7 and p16INK4A levels found in a PDX from a lethal case led to detection of a similar profile among recurrent HPV+ HNSCCs in two patient cohorts, where low E2F target gene expression downstream of E7 predicted recurrence and mortality. Our findings bridge a critical gap in preclinical models for HPV+ HNSCCs and simultaneously reveal novel applications for mutational burden and E2F target dysregulation in biomarker development.

ABSTRACT Therapy with radiation plus cisplatin kills human papilloma virus-related (HPV+) oropharyngeal squamous cell carcinomas (OPSCCs) by increasing reactive oxygen species beyond cellular antioxidant capacity. To explore why some patients fail these standard treatments, we evaluated whether the variation in HPV oncoprotein levels among HPV+ OPSCCs impacts mitochondrial metabolism, a source of antioxidant capacity. In cell line and patient-derived xenograft models, levels of HPV full-length E6 (fl-E6) inversely correlated with oxidative phosphorylation, antioxidant capacity, and therapy resistance, and fl-E6 was the only HPV oncoprotein to display such correlation. Ectopically expressing fl-E6 in models with low levels reduced mitochondrial mass, depleted antioxidant capacity, and sensitized to therapy. In this setting, fl-E6 repressed the PGC-1α/ERRα pathway for mitochondrial biogenesis by reducing p53-dependent PGC-1α transcription. Concordant observations were made in three clinical cohorts, where expression of mitochondrial components was higher in tumors of patients with reduced survival. These tumors contained the lowest fl-E6 levels, highest p53 target gene expression, and an activated PGC-1α/ERRα pathway. Our findings demonstrate that E6 can potentiate treatment responses by depleting mitochondrial antioxidant capacity and provide evidence for low E6 negatively impacting patient survival. E6’s interaction with the PGC-1α/ERRα axis has implications for predicting and targeting treatment resistance in OPSCC.

ABSTRACT Objectives The DepMap genome-wide loss of function CRISPR screens offer new insight into gene dependencies in HPV(-) head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. We aimed to leverage this data to guide preclinical studies by cataloging novel targetable dependencies that are predicted to offer a useful therapeutic window. We also aimed to identify targets potentially representing synthetic lethalities by testing for associations between genetic alterations and gene dependency profile. Methods DepMap was queried for gene probability and effect scores in cell lines from 87 tumors, including 63 HPV(-) HNSCCs plus 24 esophageal squamous cell carcinomas (ESCCs), which have comparable etiology, tissue or origin, and genetic profile to HNSCC. A probability score of ≥ 0.5 was used as the threshold for essentiality. Essential genes were selected for analysis by 4 criteria: (1) presence in ≥10% cell lines, (2) lack of common essential designation by DepMap, (3) lack of predicted dependency in normal cell lineages, and (4) designation as druggable by the Drug-Gene Interaction Database. Results The 143 genes meeting selection criteria had a median gene effect score of 0.56. Selection criteria captured targets of standard therapeutic agents of HNSCC including TYMS (5-FU), tubulin genes (taxanes), EGFR (cetuximab), plus additional known oncogenes like PIK3CA and ERBB3 . Functional classification analysis showed enrichment of tyrosine kinases, serine/threonine kinases, RNA-binding proteins, and mitochondrial carriers. 90% of the 143 dependencies were not known oncogenes in the OncoKB Database. 10% of targets had inhibitors previously used in a non-HNSCC phase II trial, including 8 that have not yet been tested in cancer. The 13 genes with median gene effect scores greater than of PIK3CA and not well-studied in HNSCC were assigned highest priority, including DHRSX, MBTPS1, TDP2, FARS2, TMX2, RAB35, CFLAR, GPX4, SLC2A1, TP63, PKN2, MAP3K11, and TIPARP . A novel association was found between NOTCH1 mutation and increased TAP1 dependency. Conclusions The DepMap CRISPR screens capture well-studied targets in HNSCC as well as numerous genes without known roles in HNSCC or malignancy in general. Several of these targets have well-developed inhibitors that provide resources to guide preclinical studies. Association of some of the dependencies with known molecular subgroups in HNSCC may enhance use of cell line models to guide personalization of therapy.