To determine the fate of anti-DNA antibody-bearing B cells in normal mice, we generated transgenic mice bearing the heavy (H) and light (L) chain genes of a well-characterized anti-double-stranded DNA antibody. This antibody was originally isolated from a diseased MRL/lpr mouse and has characteristics common to spontaneously arising anti-DNA antibodies. Results show that the H/L transgene (tg) immunoglobulin receptor is not expressed by animals bearing both tgs, although single tg animals (H or L) express their transgenes. Young H/L tg animals express few B cells, whereas adult H/L tg animals maintain almost normal B cell numbers. Analysis of the immunoglobulin receptors used by adult B cells shows that all contain the tg H chain in association with endogenous L chains. These B cells transcribe the L tg as well as the rearranged endogenous L chain gene, and loss of endogenous L chain gene transcription results in resurrection of the 3H9 H/L tg product. Examination of the endogenous L chains used by these cells shows that they represent a highly restricted subset of V genes. Taken together, these data suggest that autoreactive transgenic B cells can rearrange endogenous L chain genes to alter surface receptors. Those L chains that compete successfully with the L tg for H chain binding, and that create a nonautoreactive receptor, allow the B cell to escape deletion. We suggest that this receptor editing is a mechanism used by immature autoreactive B cells to escape tolerance.

α(1,3)Fucosylated oligosaccharides represent components of leukocyte counterreceptors for E- and P-selectins and of L-selectin ligands expressed by lymph node high endothelial venules (HEV). The identity of the α(1,3)fucosyltransferase(s) required for their expression has been uncertain, as has a requirement for α(1,3)fucosylation in HEV L-selectin ligand activity. We demonstrate here that mice deficient in α(1,3)fucosyltransferase Fuc-TVII exhibit a leukocyte adhesion deficiency characterized by absent leukocyte E- and P-selectin ligand activity and deficient HEV L-selectin ligand activity. Selectin ligand deficiency is distinguished by blood leukocytosis, impaired leukocyte extravasation in inflammation, and faulty lymphocyte homing. These observations demonstrate an essential role for Fuc-TVII in E-, P-, and L-selectin ligand biosynthesis and imply that this locus can control leukocyte trafficking in health and disease.

Pitx2 is a homeodomain transcription factor that is mutated in Rieger syndrome, a haploinsufficiency disorder affecting eyes and teeth. Pitx2 also has a postulated role in left-right axis determination. We assessed the requirements for Pitx2 directly by generating hypomorphic and null alleles. Heterozygotes for either allele have eye abnormalities consistent with Rieger syndrome. The ventral body wall fails to close in embryos homozygous for the null allele, leaving the heart and abdominal organs externalized and the body axis contorted. In homozygotes for either allele, the heart tube undergoes normal, rightward looping and the stomach is positioned normally. In contrast, homozygotes for both alleles exhibit right isomerization of the lungs. Thus, Pitx2 is required for left-right asymmetry of the lungs but not other organs. Homozygotes for either allele exhibit septal and valve defects, and null homozygotes have a single atrium proving that a threshold level of Pitx2 is required for normal heart development. Null homozygotes exhibit arrest of pituitary gland development at the committed Rathke pouch stage and eye defects including optic nerve coloboma and absence of ocular muscles. This allelic series establishes that Pitx2 is required for the development of mulitple organs in a dosage-sensitive manner.

SELF-REACTIVE B cells can be regulated by either deletion or inactivation1. These manifestations of self-tolerance have been dramatically shown in transgenic mice in which the number of self-reactive cells has been artificially expanded2,3. We have now extended these models to ask if B-cell tolerance as described for non-disease-associated antigens also operates for the targets of autoimmunity. The target we have chosen is DNA. Anti-DNA antibodies are diagnostic of certain autoimmune syndromes in humans and are a characteristic of the murine model of systemic autoimmunity, the MRI/ipr mouse4. Antibodies to both single-stranded and double-stranded DNA have been implicated in disease5,6. By generating anti-DNA transgenic mice, we have addressed the question of whether DNA-specific B cells are regulated in normal (non-autoimmune) mice. We indeed found that most transgenic B cells bind DNA, yet we failed to detect secreted anti-DNA. We suggest that as a consequence of their self-reactivity these B cells are developmentally arrested.

DFNB3 , a locus for nonsyndromic sensorineural recessive deafness, maps to a 3-centimorgan interval on human chromosome 17p11.2, a region that shows conserved synteny with mouse shaker-2 . A human unconventional myosin gene, MYO15 , was identified by combining functional and positional cloning approaches in searching for shaker-2 and DFNB3 . MYO15 has at least 50 exons spanning 36 kilobases. Sequence analyses of these exons in affected individuals from three unrelated DFNB3 families revealed two missense mutations and one nonsense mutation that cosegregated with congenital recessive deafness.

The shaker-2 mouse mutation, the homolog of human DFNB3 , causes deafness and circling behavior. A bacterial artificial chromosome (BAC) transgene from the shaker-2 critical region corrected the vestibular defects, deafness, and inner ear morphology of shaker-2 mice. An unconventional myosin gene, Myo15 , was discovered by DNA sequencing of this BAC. Shaker-2 mice were found to have an amino acid substitution at a highly conserved position within the motor domain of this myosin. Auditory hair cells of shaker-2 mice have very short stereocilia and a long actin-containing protrusion extending from their basal end. This histopathology suggests that Myo15 is necessary for actin organization in the hair cells of the cochlea.

Abstract Background Congenital hypopituitarism (CH) and its associated syndromes, septo-optic dysplasia (SOD) and holoprosencephaly (HPE), are midline defects that cause significant morbidity for affected people. Variants in 67 genes are associated with CH, but a vast majority of CH cases lack a genetic diagnosis. Whole exome and whole genome sequencing of CH patients identifies sequence variants in genes known to cause CH, and in new candidate genes, but many of these are variants of uncertain significance (VUS). Methods The International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) is an effort to establish gene function by knocking-out all genes in the mouse genome and generating corresponding phenotype data. We used mouse embryonic imaging data generated by the Deciphering Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD) project to screen 209 embryonic lethal and sub-viable knockout mouse lines for pituitary malformations. Results Of the 209 knockout mouse lines, we identified 51 that have embryonic pituitary malformations. These genes not only represent new candidates for CH, but also reveal new molecular pathways not previously associated with pituitary organogenesis. We used this list of candidate genes to mine whole exome sequencing data of a cohort of patients with CH, and we identified variants in two unrelated cases for two genes, MORC2 and SETD5 , with CH and other syndromic features. Conclusions The screening and analysis of IMPC phenotyping data provide proof-of-principle that recessive lethal mouse mutants generated by the knockout mouse project are an excellent source of candidate genes for congenital hypopituitarism in children.

Abstract Pituitary thyrotropes are specialized cells that produce thyroid stimulating hormone (TSH), a critical factor for growth and maintenance of metabolism. The transcription factors POU1F1 and GATA2 have been implicated in thyrotrope fate and transcriptional regulation of the beta subunit of TSH, Tshb , but no transcriptomic or epigenomic analyses of these cells has been undertaken. The goal of this work was to discover key transcriptional regulatory elements that drive thyrotrope fate. We identified the transcription factors and epigenomic changes in chromatin that are associated with differentiation of POU1F1-expressing progenitors into thyrotropes, a process modeled by two cell lines: one that represents an early, undifferentiated Pou1f1 lineage progenitor (GHF-T1) and one that is a committed thyrotrope that produces TSH (TαT1). We generated and compared RNA-seq, ATAC-seq, histone modification (including H3K27Ac, H3K4Me1, and H3K27Me3), and transcription factor (POU1F1) binding in these two cell lines to identify regulatory elements and candidate transcriptional regulators. We identified POU1F1 binding sites that were unique to each cell line. POU1F1 binding sites are commonly associated with bZIP transcription factor consensus binding sites in GHF-T1 cells and Helix-Turn-Helix (HTH) or basic Helix-Loop-Helix (bHLH) factors in TαT1 cells, suggesting that these classes of transcription factors may recruit or cooperate with POU1F1 binding to unique sites. We validated enhancer function of novel elements we mapped near Cga, Pitx1, Gata2, and Tshb by transfection in TαT1 cells. Finally, we confirmed that an enhancer element near Tshb can drive expression in thyrotropes of transgenic mice, and we demonstrate that GATA2 enhances Tshb expression through this element. These results extend the ENCODE multi-omic profiling approach to an organ that is critical for growth and metabolism, which should be valuable for understanding pituitary development and disease pathogenesis.

Mutations in the transcription factor GATA2 cause lymphedema. GATA2 is necessary for the development of lymphatic valves (LVs) and lymphovenous valves (LVVs), and for the patterning of lymphatic vessels. Here, we report that GATA2 is not necessary for valvular endothelial cell (VEC) differentiation. Instead, GATA2 is required for VEC maintenance and morphogenesis. GATA2 is also necessary for the expression of cell junction molecules VE-Cadherin and Claudin5 in lymphatic vessels. We identified miR-126 as a target of GATA2, and miR-126-/- embryos recapitulate the phenotypes of mice lacking GATA2. Primary human lymphatic endothelial cells (HLECs) lacking GATA2 (GATA2ΔHLEC) have altered expression of Claudin5 and VE-Cadherin, and blocking miR-126 activity in HLECs phenocopies these changes in expression. Importantly, overexpression of miR-126 in GATA2ΔHLEC significantly rescues the cell junction defects. Thus, our work defines a new mechanism of GATA2 and uncovers miR-126 as a novel regulator of mammalian lymphatic vascular development.