Leukemia niche impacts quiescence; however, culturing patient-derived samples ex vivo is technically challenging. Here, we present a protocol for in vitro co-culture of patient-derived xenograft acute lymphoblastic leukemia (PDX-ALL) cells with human mesenchymal stem cells (MSCs). We describe steps for labeling PDX-ALL cells with CellTrace Violet dye to demonstrate MSC-primed PDX-ALL cycling. We then detail procedures to identify MSC-primed G0/quiescent PDX-ALL cells via Hoechst-33342/Pyronin Y live cell cycle analysis. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Pal et al.

Imaging flow cytometry (IFC) produces up to 12 different information-rich images of single cells at a throughput of 5000 cells per second. Yet often, cell populations are still studied using manual gating, a technique that has several drawbacks. Firstly, it is hard to reproduce. Secondly, it is subjective and biased. And thirdly, it is time-consuming for large experiments. Therefore, it would be advantageous to replace manual gating with an automated process, which could be based on stain-free measurements originating from the brightfield and darkfield image channels. To realise this potential, advanced data analysis methods are required, in particular, machine learning. Previous works have successfully tested this approach on cell cycle phase classification with both a classical machine learning approach based on manually engineered features, and a deep learning approach. In this work, we compare both approaches extensively on the complex problem of white blood cell classification. Four human whole blood samples were assayed on an ImageStream-X MK II imaging flow cytometer. Two samples were stained for the identification of 8 white blood cell types, while two other sample sets were stained for the identification of resting and active eosinophils. For both datasets, four machine learning classifiers were evaluated on stain-free imagery using stratified 5-fold cross-validation. On the white blood cell dataset the best obtained results were 0.776 and 0.697 balanced accuracy for classical machine learning and deep learning, respectively. On the eosinophil dataset this was 0.866 and 0.867 balanced accuracy. From the experiments we conclude that classifying distinct cell types based on only stain-free images is possible with these techniques. However, both approaches did not always succeed in making reliable cell subtype classifications. Also, depending on the cell type, we find that even though the deep learning approach requires less expert input, it performs on par with a classical approach.

Abstract Leukaemia cells re-program their microenvironment to provide proliferation support and protection from standard chemotherapy, molecularly targeted therapies, and immunotherapy. Although much is becoming known about molecules that drive niche-dependent treatment resistance; means of targeting these in the clinics has remained a key obstacle. To address this challenge, we have developed human induced pluripotent stem cell engineered niches ex vivo to reveal insights into druggable cancer-niche dependencies. We show that mesenchymal (iMSC) and vascular niche-like (iANG) cells support ex vivo proliferation of patient-derived leukaemia cells, impact dormancy and mediate therapy resistance. iMSC protected both non-cycling and cycling blasts against dexamethasone treatment while iANG protected only dormant blasts. Leukaemia proliferation and protection from dexamethasone induced-apoptosis was dependent on direct cell-cell contact and mediated by CDH2. To explore the therapeutic potential of disrupting this cell-cell interaction, we tested the CDH2 antagonist ADH-1 (previously in phase I / II for solid tumours) in a very aggressive patient-derived xenograft leukaemia mouse model. ADH-1 showed high in vivo efficacy. ADH-1/ dexamethasone combination therapy was superior to dexamethasone alone with no ADH1 conferred additional toxicity. These findings provide a proof-of-concept starting point to develop novel, potentially safer therapeutics that target niche-mediated cancer cell dependencies in haematological malignancies. Summary CDH2 mediated niche-dependent cancer proliferation and treatment resistance is clinically targetable via ADH-1, a low toxic agent that could be potentially repurposed for future clinical trials in acute leukaemia.