A 12 kDa cysteine-rich protein is secreted by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici during colonization of tomato xylem vessels. Peptide sequences obtained with mass spectrometry allowed identification of the coding sequence. The gene encodes a 32 kDa protein, designated Six1 for secreted in xylem 1. The central part of Six1 corresponds to the 12 kDa protein found in xylem sap of infected plants. A mutant that had gained virulence on a tomato line with the I-3 resistance gene was found to have lost the SIX1 gene along with neighbouring sequences. Transformation of this mutant with SIX1 restored avirulence on the I-3 line. Conversely, deletion of the SIX1 gene in a wild-type strain results in breaking of I-3-mediated resistance. These results suggest that I-3-mediated resistance is based on recognition of Six1 secreted in xylem vessels.

SUMMARY Secreted proteins are known to play decisive roles in plant-fungus interactions. To study the molecular details of the interaction between the xylem-colonizing, plant-pathogenic fungus Fusarium oxysporum and tomato, the composition of the xylem sap proteome of infected tomato plants was investigated and compared with that of healthy plants. Two-dimensional gel separation and mass spectrometry yielded peptide masses and peptide sequences of 33 different proteins. Despite the absence of complete genome sequences of either tomato or F. oxysporum, 21 proteins were identified as tomato proteins and seven as fungal proteins. Thirteen of the tomato proteins were specific for infected plants. Sixteen tomato proteins were found in xylem sap for the first time, four of which were identified based on matches to expressed sequences only. Coding sequences for new proteins from F. oxysporum were identified through either direct matching to a database sequence, matching of peptide sequences to genome or expressed sequence tag databases of other Fusarium species, or PCR with degenerate primers on cDNA derived from infected plants followed by screening of a F. oxysporum BAC library. Together, these findings provide an excellent basis for further exploration of the interaction between xylem-colonizing pathogens and their hosts.

Summary During tomato leaf colonization, the biotrophic fungus Cladosporium fulvum secretes several effector proteins into the apoplast. Eight effectors have previously been characterized and show no significant homology to each other or to other fungal genes. To discover novel C. fulvum effectors that might play a role in virulence, we utilized two‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D‐PAGE) to visualize proteins secreted during C. fulvum –tomato interactions. Three novel C. fulvum proteins were identified: CfPhiA, Ecp6 and Ecp7. CfPhiA shows homology to proteins found on fungal sporogenous cells called phialides. Ecp6 contains lysin motifs (LysM domains) that are recognized as carbohydrate‐binding modules. Ecp7 encodes a small, cysteine‐rich protein with no homology to known proteins. Heterologous expression of Ecp6 significantly increased the virulence of the vascular pathogen Fusarium oxysporum on tomato. Furthermore, by RNA interference (RNAi)‐mediated gene silencing we demonstrate that Ecp6 is instrumental for C. fulvum virulence on tomato. Hardly any allelic variation was observed in the Ecp6 coding region of a worldwide collection of C. fulvum strains. Although none of the C. fulvum effectors identified so far have obvious orthologues in other organisms, conserved Ecp6 orthologues were identified in various fungal species. Homology‐based modelling suggests that the LysM domains of C. fulvum Ecp6 may be involved in chitin binding.

Abstract The method of 15 N metabolic labelling of Bacillus subtilis enabled mass spectrometric quantification of relative protein levels in the vegetative cells and the spores of this model organism. A total of 1501 proteins have been identified from the combined spore and vegetative cell samples. From these 1086 proteins have been relatively and reproducibly quantified between spores and vegetative cells. Of the quantified proteins, 60% are common to the vegetative cells and spores, indicating that spores host a minimal set proteins sufficient for the resumption of metabolism upon completion of germination. The shared proteins represent, the most basic ‘survival kit’ for life on earth that is known thus far.

Bacillus subtilis forms highly resistant, metabolically inactive dormant spores upon nutrient limitation. These endospores pose challenges to the food and medical sectors. Spores reactivate their metabolism upon contact with germinants and develop into vegetative cells. The activation of the molecular machinery that triggers the progress of germination and spore outgrowth is still unsettled. To gain further insight in spore germination and outgrowth processes, the transcriptome and proteome changeover during spore germination and outgrowth to vegetative cells, was analysed. B. subtilis transcriptome analysis allow us to trace the different functional groups of genes expressed. For each time-point sample, the change in the spore proteome was quantitatively monitored relative to the reference proteome of 15N metabolically labelled vegetative cells. We observed until the phase transition, i.e. completion of germination, no significant change in the proteome. We have identified 36 transcripts present abundantly in the dormant spores. This number is in close agreement with the previous findings. These transcripts mainly belong to the genes encoding small acid soluble proteins ( sspE, sspO, sspI, sspK, sspF ) and proteins with uncharacterized functions. We observed in total 3152 differentially expressed genes, but ‘only’ 323 differentially expressed proteins (total 451 proteins identified and quantified). Our data shows that 173 proteins from dormant spores, both spore unique proteins and protein shared with vegetative cells, are lost during the phase transitioning period. This loss is in addition to the active protein degradation, undertaken by the spore proteases such as Gpr, as germination and outgrowth proceeds. Further analysis is required to functionally interpret the observed protein loss. The observed diverse timing of the synthesis of different protein sets reveals a putative core-strategy of the revival of ‘life’ starting from the B. subtilis spore.

Identification of dynamic protein-protein interactions at the peptide level on a proteomic scale is a challenging approach that is still in its infancy. We have developed a system to cross-link cells directly in culture with the special lysine cross-linker bis(succinimidyl)-3-azidomethyl-glutarate (BAMG). We used the Gram positive model bacterium Bacillus subtilis as an exemplar system. Within 5 min extensive intracellular cross-linking was detected, while intracellular cross-linking in a Gram-negative species, Escherichia coli, was still undetectable after 30 min, in agreement with the low permeability in this organism for lipophilic compounds like BAMG. We were able to identify 82 unique inter-protein cross-linked peptides with less than a 1% false discovery rate by mass spectrometry and genome-wide data base searching. Nearly 60% of the inter-protein cross-links occur in assemblies involved in transcription and translation. Several of these interactions are new, and we identified a binding site between the δ and βʹ subunit of RNA polymerase close to the downstream DNA channel, providing a clue into how δ might regulate promoter selectivity and promote RNA polymerase recycling. Our methodology opens new avenues to investigate the functional dynamic organization of complex protein assemblies involved in bacterial growth.

Clostridioides difficile -associated infection (CDI) is a health-care-associated infection mainly transmitted via highly resistant endospores from one person to the other. In vivo , the spores need to germinate in to cells prior to establishing an infection. Bile acids and glycine, both available in sufficient amounts inside the human host intestinal tract, serve as efficient germinants for the spores. It is therefore, for better understanding of Clostridioides difficile virulence, crucial to study both the cell and spore states with respect to their genetic, metabolic and proteomic composition. In the present study, mass spectrometric relative protein quantification, based on the 14N/15N peptide isotopic ratios, has led to quantification of over 700 proteins from combined spore and cell samples. The analysis has revealed that the proteome turnover between a vegetative cell and a spore for this organism is moderate. Additionally, specific cell and spore surface proteins, vegetative cell proteins CD1228, CD3301 and spore proteins CD2487, CD2434 and CD0684 are identified as potential protein markers for C. difficile infection.![Figure][1] Abstract graphic For Table of Contents Only [1]: pending:yes