Summary

 Trained innate immunity fosters a sustained favorable response of myeloid cells to a secondary challenge, despite their short lifespan in circulation. We thus hypothesized that trained immunity acts via modulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Administration of β-glucan (prototypical trained-immunity-inducing agonist) to mice induced expansion of progenitors of the myeloid lineage, which was associated with elevated signaling by innate immune mediators, such as IL-1β and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), and with adaptations in glucose metabolism and cholesterol biosynthesis. The trained-immunity-related increase in myelopoiesis resulted in a beneficial response to secondary LPS challenge and protection from chemotherapy-induced myelosuppression in mice. Therefore, modulation of myeloid progenitors in the bone marrow is an integral component of trained immunity, which to date, was considered to involve functional changes of mature myeloid cells in the periphery.

The physical basis for protein partitioning into lipid rafts remains an outstanding question in membrane biology that has previously been addressed only through indirect techniques involving differential solubilization by nonionic detergents. We have used giant plasma membrane vesicles, a plasma membrane model system that phase separates to include an ordered phase enriching for raft constituents, to measure the partitioning of the transmembrane linker for activation of T cells (LAT). LAT enrichment in the raft phase was dependent on palmitoylation at two juxtamembrane cysteines and could be enhanced by oligomerization. This palmitoylation requirement was also shown to regulate raft phase association for the majority of integral raft proteins. Because cysteine palmitoylation is the only lipid modification that has been shown to be reversibly regulated, our data suggest a role for palmitoylation as a dynamic raft targeting mechanism for transmembrane proteins.

Several simplified membrane models featuring coexisting liquid disordered (Ld) and ordered (Lo) lipid phases have been developed to mimic the heterogeneous organization of cellular membranes, and thus, aid our understanding of the nature and functional role of ordered lipid–protein nanodomains, termed "rafts". In spite of their greatly reduced complexity, quantitative characterization of local lipid environments using model membranes is not trivial, and the parallels that can be drawn to cellular membranes are not always evident. Similarly, various fluorescently labeled lipid analogs have been used to study membrane organization and function in vitro, although the biological activity of these probes in relation to their native counterparts often remains uncharacterized. This is particularly true for raft-preferring lipids ("raft lipids", e.g. sphingolipids and sterols), whose domain preference is a strict function of their molecular architecture, and is thus susceptible to disruption by fluorescence labeling. Here, we analyze the phase partitioning of a multitude of fluorescent raft lipid analogs in synthetic Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) and cell-derived Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMVs). We observe complex partitioning behavior dependent on label size, polarity, charge and position, lipid headgroup, and membrane composition. Several of the raft lipid analogs partitioned into the ordered phase in GPMVs, in contrast to fully synthetic GUVs, in which most raft lipid analogs mis-partitioned to the disordered phase. This behavior correlates with the greatly enhanced order difference between coexisting phases in the synthetic system. In addition, not only partitioning, but also ligand binding of the lipids is perturbed upon labeling: while cholera toxin B binds unlabeled GM1 in the Lo phase, it binds fluorescently labeled GM1 exclusively in the Ld phase. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) by stimulated emission depletion (STED) nanoscopy on intact cellular plasma membranes consistently reveals a constant level of confined diffusion for raft lipid analogs that vary greatly in their partitioning behavior, suggesting different physicochemical bases for these phenomena.

The human epidermal growth factor receptor (EGFR) is a key representative of tyrosine kinase receptors, ubiquitous actors in cell signaling, proliferation, differentiation, and migration. Although the receptor is well-studied, a central issue remains: How does the compositional diversity and functional diversity of the surrounding membrane modulate receptor function? Reconstituting human EGFR into proteoliposomes of well-defined and controlled lipid compositions represents a minimal synthetic approach to systematically address this question. We show that lipid composition has little effect on ligand-binding properties of the EGFR but rather exerts a profound regulatory effect on kinase domain activation. Here, the ganglioside GM3 but not other related lipids strongly inhibited the autophosphorylation of the EGFR kinase domain. This inhibitory action of GM3 was only seen in liposomes compositionally poised to phase separate into coexisting liquid domains. The inhibition by GM3 was released by either removing the neuraminic acid of the GM3 headgroup or by mutating a membrane proximal lysine of EGFR (K642G). Our results demonstrate that GM3 exhibits the potential to regulate the allosteric structural transition from inactive to a signaling EGFR dimer, by preventing the autophosphorylation of the intracellular kinase domain in response to ligand binding.

Biological membranes are compartmentalized for functional diversity by a variety of specific protein–protein, protein–lipid, and lipid–lipid interactions. A subset of these are the preferential interactions between sterols, sphingolipids, and saturated aliphatic lipid tails responsible for liquid–liquid domain coexistence in eukaryotic membranes, which give rise to dynamic, nanoscopic assemblies whose coalescence is regulated by specific biochemical cues. Microscopic phase separation recently observed in isolated plasma membranes (giant plasma membrane vesicles and plasma membrane spheres) ( i ) confirms the capacity of compositionally complex membranes to phase separate, ( ii ) reflects the nanoscopic organization of live cell membranes, and ( iii ) provides a versatile platform for the investigation of the compositions and properties of the phases. Here, we show that the properties of coexisting phases in giant plasma membrane vesicles are dependent on isolation conditions—namely, the chemicals used to induce membrane blebbing. We observe strong correlations between the relative compositions and orders of the coexisting phases, and their resulting miscibility. Chemically unperturbed plasma membranes reflect these properties and validate the observations in chemically induced vesicles. Most importantly, we observe domains with a continuum of varying stabilities, orders, and compositions induced by relatively small differences in isolation conditions. These results show that, based on the principle of preferential association of raft lipids, domains of various properties can be produced in a membrane environment whose complexity is reflective of biological membranes.

Abstract Objective Adrenocortical hormone levels increase in obesity, potentially contributing to development of obesity-associated pathologies. Here we explored whether lipidomic remodeling of the adrenal gland could mediate altered adrenocortical steroidogenesis during obesity. Methods Lipidomic analysis was performed in adrenal glands using shotgun mass spectrometry (MS), and steroid profiling of sera by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) from lean and obese mice. Gene expression analysis was performed in adrenal glands and adrenocortical cell populations. The role of Fatty Acid Desaturase 2 (FADS2) and arachidonic acid on steroid hormone production was studied in primary adrenal gland cell cultures. Results Adrenal glands of obese mice displayed a distinct lipidomic profile, encompassing longer and more unsaturated storage lipids and phospholipids compared to adrenal glands of lean mice. Arachidonoyl acyl chains were abundant in the adrenal gland phospholipidome and increased upon obesity. This was accompanied by increased Fads2 expression, the rate-limiting enzyme of arachidonic acid synthesis, and enhanced plasma adrenocortical hormone levels. Inhibition of FADS2 in primary adrenal gland cell cultures abolished steroidogenesis, which was restored by arachidonic acid supplementation. Conclusions Our data suggest that the FADS2 – arachidonic acid axis regulates adrenocortical hormone synthesis, while alterations in the content of arachidonoyl chains in the adrenal gland phopsholipidome could account for disturbed adrenocortical hormone production. Highlights The adrenal gland lipidome is remodeled in obesity. Arachidonoyl groups are abundant in the adrenal gland phospholipidome and increase in obesity. FADS2 is highly expressed in the adrenal gland and its expression is further increased in obesity. FADS2 inhibition blunts adrenocortical steroidogenesis in primary adrenal gland cell cultures, while arachidonic acid supplementation restores it.

Summary Endocrine cells employ regulated exocytosis of secretory granules to secrete hormones and neurotransmitters. The competence of secretory granules for exocytosis depends on spatio-temporal variables such as proximity to the plasma membrane and age, with newly-generated granules being preferentially released. Despite recent advances, we still lack a comprehensive view about the molecular composition of insulin granules and how this may change over the lifetime of the organelles. Here we report a strategy for the purification of insulin secretory granules of distinct age from insulinoma INS-1 cells. Tagging the granule-resident protein phogrin with a cleavable CLIP tag, we obtained intact fractions of age-distinct granules for proteomic and lipidomic analyses. We find that the lipid composition changes over time along with the physical properties of the membrane.

Abstract Tumor-associated glycolipids such as NeuGc GM3 are auspicious molecular targets in antineoplastic therapies and vaccine strategies. 14F7 is an anti-tumor antibody with high clinical potential, which has extraordinary specificity for NeuGc GM3, but does not recognize the very similar, ubiquitous NeuAc GM3. Here we present the 2.3 Å crystal structure of the 14F7 binding domain (14F7 scFv) in complex with the NeuGc GM3 trisaccharide. Intriguingly, a water molecule appears to shape the specificity of 14F7. Using model membrane systems, we show that 14F7 recognizes NeuGc GM3 only above lipid concentrations that are likely to form glycolipid-rich domains. This “all-or-nothing” effect was exacerbated in giant unilamellar vesicles and multilamellar vesicles, whereas no binding was observed to 100 nm liposomes, emphasizing that the 14F7–NeuGc GM3 interaction is additionally modulated by membrane curvature. Unexpectedly, adding NeuAc GM3 strongly increased binding affinity to NeuGc GM3-containing liposomes. This effect may be important for tumor recognition, where the ubiquitous NeuAc GM3 may enhance 14F7 binding to NeuGc GM3-expressing cancer cells.

A calorie-rich diet is one reason for the continuous spread of metabolic syndromes in western societies. Smart food design is one powerful tool to prevent metabolic stress, and the search for suitable bioactive additives is a continuous task. The nutrient-sensing insulin signaling pathway is an evolutionary conserved mechanism that plays an important role in metabolism, growth and development. Recently, lipid cues capable to stimulate insulin signaling were identified. However, the mechanistic base of their activity remains obscure to date. Here, we show that specific AKT/ Protein kinase B isoforms are responsive to dietary lipid extract compositions and potentiate cellular insulin signaling levels. Our data add a new dimension to existing models and position Drosophila as a powerful model to study the relation between dietary lipid cues and the insulin induced cellular signal cascade.

How cold-blooded animals adapt their behaviour and physiology to survive seasonal changes in temperature is not completely understood - even for well-studied model organisms like Drosophila melanogaster. Here, we show that Drosophila can extend their viable temperature range through temperature-dependent changes in feeding behaviour. Above 15˚C, Drosophila feed and lay eggs on yeast. In contrast, below 15˚C, Drosophila prefer to feed and lay eggs on plant material. The different lipids present in yeast and plants improve survival at high and low temperatures, respectively. Yeast lipids promote high tempera-ture survival by increasing systemic insulin signalling. This expands the range over which developmental rate increases with temperature, suggesting that faster nutrient utilization is required to fuel biochemical reactions driven faster by ki-netic energy. In addition to speeding development, yeast lipids increase fertility. Thus, yeast provide cues that could help Drosophila to exploit a transient summer food resource. Plant lipids, on the other hand, are required to maintain mem-brane lipid fluidity at low temperature, and increase cold-resistance of larvae and adults. The cold-resistance and lowered insulin signalling conferred by feeding on plants allows adults to survive for many months at temperatures consistent with overwintering in temperate climates. Thus, temperature-dependent changes in feeding behaviour produce physiological changes that could promote seasonal adaption.