ABSTRACT Deep mutational scanning is a powerful method to explore the mutational fitness landscape of proteins. Its adaptation to anti-CRISPR proteins, which are natural CRISPR-Cas inhibitors and key players in the co-evolution of microbes and phages, would facilitate their in-depth characterization and optimization. Here, we developed a robust anti-CRISPR deep mutational scanning pipeline in Escherichia coli combining synthetic gene circuits based on CRISPR interference with flow cytometry-coupled sequencing and mathematical modeling. Using this pipeline, we created and characterized comprehensive single point mutation libraries for AcrIIA4 and AcrIIA5, two potent inhibitors of Streptococcus pyogenes Cas9. The resulting mutational fitness landscapes revealed that both Acrs possess a considerable mutational tolerance as well as an intrinsic redundancy with respect to Cas9 inhibitory features, suggesting evolutionary pressure towards high plasticity and robustness. Finally, to demonstrate that our pipeline can inform the optimization and fine-tuning of Acrs for genome editing applications, we cross-validated a subset of AcrIIA4 mutants via gene editing assays in mammalian cells and in vitro affinity measurements. Together, our work establishes deep mutational scanning as powerful method for anti-CRISPR protein characterization and optimization.

Abstract The worldwide spread of severe acute respiratory syndrome-related coronavirus-2 (SARS-CoV-2) caused an urgent need for an in-depth understanding of interactions between the virus and its host. Here, we dissected the dynamics of virus replication and the host cell transcriptional response to SARS-CoV-2 infection at a systems level by combining time-resolved RNA sequencing with mathematical modeling. We observed an immediate transcriptional activation of inflammatory pathways linked to the anti-viral response followed by increased expression of genes involved in ribosome and mitochondria function, thus hinting at rapid alterations in protein production and cellular energy supply. At later stages, metabolic processes, in particular those depending on cytochrome P450 enzymes, were downregulated. To gain a deeper understanding of the underlying transcriptional dynamics, we developed an ODE model of SARS-CoV-2 infection and replication. Iterative model reduction and refinement revealed that a negative feedback from virus proteins on the expression of anti-viral response genes was essential to explain our experimental dataset. Our study provides insights into SARS-CoV-2 virus-host interaction dynamics and facilitates the identification of druggable host pathways supporting virus replication.

Abstract Light-controlled transcriptional activation is a commonly used optogenetic strategy that allows researchers to regulate gene expression with high spatiotemporal precision. The vast majority of existing tools are, however, limited to light-triggered induction of gene expression. Here, we inverted this mode of action and created two complementary optogenetic systems capable of efficiently terminating transcriptional activation in response to blue light. First, we designed highly compact regulators, by photo-controlling VP16 transactivation peptide exposure. Then, applying a two-hybrid strategy, we engineered LOOMINA ( l ight o ff- o perated m odular in ductor of transcriptional a ctivation), a versatile transcriptional control platform for mammalian cells that is highly adaptable and compatible with various effector proteins. Leveraging the flexibility of CRISPR systems, we integrated LOOMINA with Cas9 as a DNA-binding domain to control transcription from various endogenous promoters with exceptionally high dynamic ranges in multiple cell lines, including neuron-like cells. Both functionally and mechanistically, LOOMINA represents a valuable addition to the optogenetic repertoire for transcriptional regulation.

Anti-CRISPR (Acr) proteins are bacteriophage-derived antagonists of CRISPR-Cas systems. To date, Acrs were obtained either by mining sequence databanks or experimentally screening phage collections, both of which yield a limited repertoire of naturally occurring variants. Here, we applied structure-based engineering on AcrIIC1, a broad-spectrum inhibitor of type II-C CRISPR systems, to improve its efficacy and expand its specificity. We first show that fusing exogenous protein domains into AcrIIC1 dramatically enhances inhibition of the natural Neisseria meningitidis Cas9 target. Then, using structure-guided design, we converted AcrIIC1 into AcrX, a potent inhibitor of the type II-A CRISPR-Cas9 from Staphylococcus aureus widely applied for in vivo genome editing. Our work introduces designer Acrs as important biotechnological tools and provides an innovative strategy to safeguard the CRISPR technology.

ABSTRACTOptogenetic control of CRISPR-Cas9 systems has significantly improved our ability to perform genome perturbations in living cells with high precision in time and space. As new Cas orthologues with advantageous properties are rapidly being discovered and engineered, the need for straightforward strategies to control their activity via exogenous stimuli persists. The Cas9 from Neisseria meningitidis (Nme) is a particularly small and target-specific Cas9 orthologue, and thus of high interest for in vivo genome editing applications.Here, we report the first optogenetic tool to control NmeCas9 activity in mammalian cells via an engineered, light-dependent anti-CRISPR (Acr) protein. Building on our previous Acr engineering work, we created hybrids between the NmeCas9 inhibitor AcrIIC3 and the LOV2 blue light sensory domain from Avena sativa. Two AcrIIC3-LOV2 hybrids from our collection potently blocked NmeCas9 activity in the dark, while permitting robust genome editing at various endogenous loci upon blue light irradiation. Structural analysis revealed that, within these hybrids, the LOV2 domain is located in striking proximity to the Cas9 binding surface. Together, our work demonstrates optogenetic regulation of a type II-C CRISPR effector and might suggest a new route for the design of optogenetic Acrs.

Abstract Domain insertion engineering is a promising approach to recombine the functions of evolutionarily unrelated proteins. Insertion of light-switchable receptor domains into a selected effector protein, for instance, can yield allosteric effectors with light-dependent activity. However, the parameters that determine domain insertion tolerance are poorly understood. Here, we used an unbiased screen to systematically assess the domain insertion permissibility of several evolutionary unrelated proteins. Training machine learning models on the resulting data allowed us to dissect features informative for domain insertion tolerance and revealed sequence conservation statistics as the strongest indicators of suitable insertion sites. Finally, extending our experimental pipeline towards the identification of switchable hybrids resulted in opto-chemogenetic derivatives of the transcription factor AraC that function as single-protein Boolean logic gates. Our study reveals determinants of domain insertion tolerance and facilitates the engineering of switchable proteins with unique mechanistic properties.

Deep mutational scanning is a powerful method for exploring the mutational fitness landscape of proteins. Its adaptation to anti-CRISPR proteins, which are natural CRISPR-Cas inhibitors and key players in the co-evolution of microbes and phages, facilitates their characterization and optimization. Here, we developed a robust anti-CRISPR deep mutational scanning pipeline in Escherichia coli that combines synthetic gene circuits based on CRISPR interference with flow cytometry coupled sequencing and mathematical modeling. Using this pipeline, we characterized comprehensive single point mutation libraries for AcrIIA4 and AcrIIA5, two potent inhibitors of CRISPR-Cas9. The resulting mutational fitness landscapes revealed considerable mutational tolerance for both Acrs, suggesting an intrinsic redundancy with respect to Cas9 inhibitory features, and - for AcrIIA5 - indicated mutations that boost Cas9 inhibition. Subsequent in vitro characterization suggested that the observed differences in inhibitory potency between mutant inhibitors were mostly due to changes in binding affinity rather than protein expression levels. Finally, to demonstrate that our pipeline can inform Acrs-based genome editing applications, we employed a selected subset of mutant inhibitors to increase CRISPR-Cas9 target specificity by modulating Cas9 activity. Taken together, our work establishes deep mutational scanning as a powerful method for anti-CRISPR protein characterization and optimization.