Never-dried and once-dried hardwood celluloses were oxidized by a 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical (TEMPO)-mediated system, and highly crystalline and individualized cellulose nanofibers, dispersed in water, were prepared by mechanical treatment of the oxidized cellulose/water slurries. When carboxylate contents formed from the primary hydroxyl groups of the celluloses reached approximately 1.5 mmol/g, the oxidized cellulose/water slurries were mostly converted to transparent and highly viscous dispersions by mechanical treatment. Transmission electron microscopic observation showed that the dispersions consisted of individualized cellulose nanofibers 3−4 nm in width and a few microns in length. No intrinsic differences between never-dried and once-dried celluloses were found for preparing the dispersion, as long as carboxylate contents in the TEMPO-oxidized celluloses reached approximately 1.5 mmol/g. Changes in viscosity of the dispersions during the mechanical treatment corresponded with those in the dispersed states of the cellulose nanofibers in water.

Agonist-induced activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) is known to cause adipocyte differentiation and insulin sensitivity. The biological role of PPARγ was investigated by gene targeting. Homozygous PPARγ-deficient embryos died at 10.5–11.5 dpc due to placental dysfunction. Quite unexpectedly, heterozygous PPARγ-deficient mice were protected from the development of insulin resistance due to adipocyte hypertrophy under a high-fat diet. These phenotypes were abrogated by PPARγ agonist treatment. Heterozygous PPARγ-deficient mice showed overexpression and hypersecretion of leptin despite the smaller size of adipocytes and decreased fat mass, which may explain these phenotypes at least in part. This study reveals a hitherto unpredicted role for PPARγ in high-fat diet–induced obesity due to adipocyte hypertrophy and insulin resistance, which requires both alleles of PPARγ.

Adiponectin is an adipocyte-derived hormone, which has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Eight mutations in human adiponectin have been reported, some of which were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia, but the molecular mechanisms of decreased plasma levels and impaired action of adiponectin mutants were not clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and is known to form a characteristic homomultimer. Herein, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Adiponectin in human or mouse serum and adiponectin expressed in NIH-3T3 or Escherichia coli formed a wide range of multimers from trimers to high molecular weight (HMW) multimers. A disulfide bond through an amino-terminal cysteine was required for the formation of multimers larger than a trimer. An amino-terminal Cys-Ser mutation, which could not form multimers larger than a trimer, abrogated the effect of adiponectin on the AMP-activated protein kinase pathway in hepatocytes. Among human adiponectin mutations, G84R and G90S mutants, which are associated with diabetes and hypoadiponectinemia, did not form HMW multimers. R112C and I164T mutants, which are associated with hypoadiponectinemia, did not assemble into trimers, resulting in impaired secretion from the cell. These data suggested impaired multimerization and/or the consequent impaired secretion to be among the causes of a diabetic phenotype or hypoadiponectinemia in subjects having these mutations. In conclusion, not only total concentrations, but also multimer distribution should always be considered in the interpretation of plasma adiponectin levels in health as well as various disease states. Adiponectin is an adipocyte-derived hormone, which has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Eight mutations in human adiponectin have been reported, some of which were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia, but the molecular mechanisms of decreased plasma levels and impaired action of adiponectin mutants were not clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and is known to form a characteristic homomultimer. Herein, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Adiponectin in human or mouse serum and adiponectin expressed in NIH-3T3 or Escherichia coli formed a wide range of multimers from trimers to high molecular weight (HMW) multimers. A disulfide bond through an amino-terminal cysteine was required for the formation of multimers larger than a trimer. An amino-terminal Cys-Ser mutation, which could not form multimers larger than a trimer, abrogated the effect of adiponectin on the AMP-activated protein kinase pathway in hepatocytes. Among human adiponectin mutations, G84R and G90S mutants, which are associated with diabetes and hypoadiponectinemia, did not form HMW multimers. R112C and I164T mutants, which are associated with hypoadiponectinemia, did not assemble into trimers, resulting in impaired secretion from the cell. These data suggested impaired multimerization and/or the consequent impaired secretion to be among the causes of a diabetic phenotype or hypoadiponectinemia in subjects having these mutations. In conclusion, not only total concentrations, but also multimer distribution should always be considered in the interpretation of plasma adiponectin levels in health as well as various disease states. Adiponectin (also known as ACRP30, 1The abbreviations used are: ACRP30, adipocyte complement-related protein of 30kDa; HMW, high molecular weight; GBP28, gelatin binding protein of 28kDa; MMW, middle molecular weight; LMW, low molecular weight; AMPK, AMP-activated protein kinase; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium; ACC, acetyl-CoA carboxylase; TBS, Tris-buffered saline; PBS, phosphate-buffered saline; WT, wild-type; BS3, Bis (sulfosuccimidyl) suberate; SP-A, Surfactant protein-A; SP-D, Surfactant protein-D.1The abbreviations used are: ACRP30, adipocyte complement-related protein of 30kDa; HMW, high molecular weight; GBP28, gelatin binding protein of 28kDa; MMW, middle molecular weight; LMW, low molecular weight; AMPK, AMP-activated protein kinase; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium; ACC, acetyl-CoA carboxylase; TBS, Tris-buffered saline; PBS, phosphate-buffered saline; WT, wild-type; BS3, Bis (sulfosuccimidyl) suberate; SP-A, Surfactant protein-A; SP-D, Surfactant protein-D. GBP28, and AdipoQ) (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 2Hu E. Liang P. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10697-10703Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1879) Google Scholar, 3Maeda K. Okubo K. Shimomura I. Funahashi T. Matsuzawa Y. Matsubara K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 221: 286-289Crossref PubMed Scopus (1838) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar) is a hormone secreted exclusively from adipocytes and has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Adiponectin concentrations are reduced in obese and insulin-resistant human subjects and animal models (2Hu E. Liang P. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10697-10703Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1879) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar). Genetic deletion of adiponectin in mice (7Kubota N. Terauchi Y. Yamauchi T. Kubota T. Moroi M. Matsui J. Eto K. Yamashita T. Kamon J. Satoh H. Yano W. Froguel P. Nagai R. Kimura S. Kadowaki T. Noda T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25863-25866Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1181) Google Scholar, 8Maeda N. Shimomura I. Kishida K. Nishizawa H. Matsuda M. Nagaretani H. Furuyama N. Kondo H. Takahashi M. Arita Y. Komuro R. Ouchi N. Kihara S. Tochino Y. Okutomi K. Horie M. Takeda S. Aoyama T. Funahashi T. Matsuzawa Y. Nat. Med. 2002; 8: 731-737Crossref PubMed Scopus (1804) Google Scholar) or adiponectin supplementation of an insulin-resistant obese murine model (6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar, 9Berg A.H. Combs T.P. Du X. Brownlee M. Scherer P.E. Nat. Med. 2001; 7: 947-953Crossref PubMed Scopus (2198) Google Scholar), has demonstrated that reduced plasma adiponectin levels caused by genetic or nutritional factors to be one of the important causes of type 2 diabetes development. On the other hand, adiponectin is mapped to chromosome locus 3q27, which is reportedly the locus closely associated with type 2 diabetes based on genome-wide scans in several ethnic groups (10Mori Y. Otabe S. Dina C. Yasuda K. Populaire C. Lecoeur C. Vatin V. Durand E. Hara K. Okada T. Tobe K. Boutin P. Kadowaki T. Froguel P. Diabetes. 2002; 51: 1247-1255Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar, 11Vionnet N. Hani E.H. Dupont S. Gallina S. Francke S. Dotte S. De Matos F. Durand E. Lepretre F. Lecoeur C. Gallina P. Zekiri L. Dina C. Froguel P. Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 1470-1480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (618) Google Scholar, 12Kissebah A.H. Sonnenberg G.E. Myklebust J. Goldstein M. Broman K. James R.G. Marks J.A. Krakower G.R. Jacob H.J. Weber J. Martin L. Blangero J. Comuzzie A.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 14478-14483Crossref PubMed Scopus (569) Google Scholar). The G allele of single nucleotide polymorphism (SNP) 276 in adiponectin is associated with hypoadiponectinemia and type 2 diabetes (13Hara K. Boutin P. Mori1 Y. Tobe K. Dina C. Yasuda K. Yamauchi T. Otabe S. Okada T. Eto K. Kadowaki H. Hagura R. Akanuma Y. Yazaki Y. Nagai R. Taniyama M. Matsubara K. Yoda M. Nakano Y. Kimura S. Tomita M. Kimura S. Ito C. Froguel P. Kadowaki T. Diabetes. 2002; 51: 536-540Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar). Eight mutations in human adiponectin have been reported (13Hara K. Boutin P. Mori1 Y. Tobe K. Dina C. Yasuda K. Yamauchi T. Otabe S. Okada T. Eto K. Kadowaki H. Hagura R. Akanuma Y. Yazaki Y. Nagai R. Taniyama M. Matsubara K. Yoda M. Nakano Y. Kimura S. Tomita M. Kimura S. Ito C. Froguel P. Kadowaki T. Diabetes. 2002; 51: 536-540Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar, 14Takahashi M. Arita Y. Yamagata K. Matsukawa Y. Okutomi K. Horie M. Shimomura I. Hotta K. Kuriyama H. Kihara S. Nakamura T. Yamashita S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2000; 24: 861-868Crossref PubMed Scopus (325) Google Scholar, 15Kondo H. Shimomura I. Matsukawa Y. Kumada M. Takahashi M. Matsuda M. Ouchi N. Kihara S. Kawamoto T. Sumitsuji S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Diabetes. 2002; 51: 2325-2328Crossref PubMed Scopus (342) Google Scholar, 16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Several mutations were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia (15Kondo H. Shimomura I. Matsukawa Y. Kumada M. Takahashi M. Matsuda M. Ouchi N. Kihara S. Kawamoto T. Sumitsuji S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Diabetes. 2002; 51: 2325-2328Crossref PubMed Scopus (342) Google Scholar, 16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Molecular mechanisms underlying the development of diabetes and hypoadiponectinemia have yet to be clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and consists of a carboxyl-terminal globular domain and an amino-terminal collagenous domain (17Shapiro L. Scherer P.E. Curr. Biol. 1998; 8: 335-338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 18Yokota T. Oritani K. Takahashi I. Ishikawa J. Matsuyama A. Ouchi N. Kihara S. Funahashi T. Tenner A.J. Tomiyama Y. Matsuzawa Y. Blood. 2000; 96: 1723-1732Crossref PubMed Google Scholar). This family is also known to form characteristic multimers (19Crouch E. Persson A. Chang D. Heuser J. J. Biol. Chem. 1994; 269: 17311-17319Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20McCormack F.X. Pattanajitvilai S. Stewart J. Possmayer F. Inchley K. Voelker D.R. J. Biol. Chem. 1997; 272: 27971-27979Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (62) Google Scholar). Gel filtration and velocity gradient studies revealed adiponectin circulating in serum to form several different molecular weight species; the largest species was more than several hundred kilodaltons in size (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). In this study, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Applying this method, we investigated the molecular structure and mode of multimerization of adiponectin from human or mouse serum and cultured cells. Since we speculated that adiponectin mutations might alter multimer formations of adiponectin, we analyzed these mutants with SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. We demonstrated impaired multimerization and secretion in these mutants to possibly contribute to the development of diabetes and hypoadiponectinemia. Adiponectin has been shown to be one of the major regulators of energy homeostasis and insulin sensitivity. This study sheds new light on the molecular structure-function relationship. Materials—Trypsin V-S, Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), anti-FLAG M2 antibody cross-linked to agarose, and FLAG peptide were purchased from Sigma. 2-Mercaptoethanol was purchased from Wako Pure Chemicals. Mammalian expression vector pcDNA3.1(+) was purchased from Invitrogen. Prokaryotic expression vector PQE30 and Ni-NTA agarose were purchased from Qiagen. Superdex S300HR 10/30 was purchased from Amersham Biosciences. Anti-phosphorylated AMP-activated protein kinase (AMPK) antibody and anti-phosphorylated acetyl-CoA carboxylase (ACC) antibody were purchased from Cell Signaling. Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody was purchased from Zymed Laboratories Inc.. Cell Culture—NIH-3T3 fibroblasts were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum in an incubator with 5% CO2 at 37 °C. 3T3-L1 adipocytes were maintained as subconfluent cultures in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated to mature adipocytes by a conventional method (22Miki H. Yamauchi T. Suzuki R. Komeda K. Tsuchida A. Kubota N. Terauchi Y. Kamon J. Kaburagi Y. Matsui J. Akanuma Y. Nagai R. Kimura S. Tobe K. Kadowaki T. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 2521-2532Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar). Myocyte cell line C2C12 and primary hepatocytes were cultured as described in Ref. 23Yamauchi T. Kamon J. Minokoshi Y. Ito Y. Waki H. Uchida S. Yamashita S. Noda M. Kita S. Ueki K. Eto K. Akanuma Y. Froguel P. Foufelle F. Ferre P. Carling D. Kimura S. Nagai R. Kahn B.B. Kadowaki T. Nat. Med. 2002; 8: 1288-1295Crossref PubMed Scopus (3419) Google Scholar. Cloning, Recombinant Expression, and Purification of Adiponectin—A murine adiponectin coding sequence (NCBI accession no. U37222) flanked by a Kozak sequence was cloned from mouse white adipose tissue and inserted between EcoRI and NotI in the multiple cloning site of pcDNA3.1(+). Human adiponectin (NCBI accession no. D45371) was also cloned into pcDNA3.1(+) in the same manner. For mammalian expression, NIH-3T3 fibroblasts were transfected with expression vectors using LipofectAMINE (Invitrogen) according to the manufacturer's instruction. For the purification of recombinant adiponectin from NIN-3T3 fibroblast medium, we prepared an expression vector in which the FLAG tag sequence, 5′-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3′ (DYKDDDDK in amino acids) was inserted into the carboxyl terminus of adiponectin. NIH-3T3 fibroblasts were transfected with the FLAG-tagged adiponectin expression vector and recombinant protein was allowed to secrete into the medium for 48 h. Collected medium was applied to an anti-FLAG affinity column. The column was washed with Tris-buffered saline (10 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, pH7.5, TBS) and bound recombinant adiponectin was eluted with FLAG peptide. Adiponectin-rich fractions were collected and dialyzed against TBS. For prokaryotic expression, the coding sequence deprived of the signal sequence (corresponding to residues 18-247) of mouse adiponectin was inserted between BamHI and HindIII of the PQE30 expression vector, which expressed the His6 tag attached to the amino terminus of adiponectin. For the globular domain, the sequence corresponding the residues 104-247 was inserted. Expression and purification of His-tagged adiponectin from the Escherichia coli lysate was performed as described in Ref. 6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar. Briefly, the soluble fraction of the E. coli lysate was applied to Ni-NTA agarose, washed thoroughly and bound adiponectin was eluted stepwise with imidazole. Fractions containing adiponectin was collected and extensively dialyzed against phosphate-buffered saline (PBS). Site-directed Mutagenesis of Adiponectin—Mouse C39S mutant adiponectin was generated using a site-directed mutagenesis kit (Stratagene) according to the manufacturer's protocol. The sense primer was 5′-CACCCAAGGGAACTAGTGCAGGTTGGATGG-3′ and the antisense primer was complementary to it. For human adiponectin mutagenesis, the sense primers were 5′-CATCGGTGAAACCAGAGTACCCGGGGC-3′ for G84R, 5′-CGGGGCTGAAAGTCCCCGAGGCTTTC-3′ for G90S, 5′-GCTGAAGGTCCCTGAGGCTTTCCG GG-3′ for R92X, 5′-GGTGCCTATGTACACCGCTCAGCATTCAGT G-3′ for Y111H, 5′-GGTGCCTATGTATACTGCTCAGCATTCAGTGTGG-3′ for R112C, 5′-CCTGG GCTGTACGACTTTGCCTACCACATC-3′ for Y159D, 5′-CTACTTTGCCTACCACACCACAGTCTATATGAAGG-3′ for I164T, 5′-GTATGGGGAAGGAGAGAGTAATGGACTCTATGCTG-3′ for R221S, and 5′-GGCTTTCTTCTCTACCCTGACACCAACTGATCAC-3′ for H241P. The antisense primers were complementary to these sense primers. The coding sequence corresponding to amino acids 19-71 (from the variable region to the middle of the collagenous region) was deleted for the expression of amino-terminally truncated human adiponectin (ΔH). The sense primer was 5′-GGTCTTATTGGTCCTAAGGGAGACATCGGTG-3′ with 5′-phosphorylation, and the antisense primer was 5′-CTGGTCATGCCCGGGCAGAGCTAATAGCAG-3′ with 5′-phosphorylation. The deleted construct was amplified from human adiponectin pcDNA3.1 by pfu Taq polymerase (Stratagene), and the gained blunted DNA fragment was self-ligated to form a circular plasmid. Generation of Anti-adiponectin Antibodies—Anti-mouse adiponectin globular domain antiserum was obtained by immunizing rabbits with mouse recombinant adiponectin globular domain produced in E. coli. Anti-mouse amino-terminal peptide antibody, and anti-human carboxyl-terminal peptide antibody were raised against the synthesized mouse amino-terminal peptide EDDVTTTEELAPALV and the human carboxyl-terminal peptide CYADNDSTFTGFLLYHDTN. Anti-human carboxyl-terminal peptide antibody showed good cross-reactivity against mouse adiponectin (data not shown). Preparation of Adiponectin Globular Domain by Trypsin Digestion of Full-length Adiponectin—Full-length adiponectin expressed in NIH-3T3 fibroblasts and secreted in DMEM without serum was cleaved by trypsin V-S according to Ref. 24Fruebis J. Tsao T-S. Javorschi S. Ebbets-Reed D. Erickson M.R.S. Yen F.T. Bihain B.E. Lodish H.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2005-2010Crossref PubMed Scopus (1742) Google Scholar. Trypsin reportedly digests full-length adiponectin at the peptide bond between Arg-103 and Lys-104, generating the globular adiponectin (24Fruebis J. Tsao T-S. Javorschi S. Ebbets-Reed D. Erickson M.R.S. Yen F.T. Bihain B.E. Lodish H.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2005-2010Crossref PubMed Scopus (1742) Google Scholar). SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Immunoblotting—SDS-PAGE was performed according to the standard Laemmli's method (25Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (206658) Google Scholar). Sample buffer for reducing conditions was 3% SDS, 50 mm Tris-HCl pH 6.8, 5% 2-mercaptoethanol and 10% glycerol. For complete reduction of serum sample, 10 mm dithiothreitol was also added to the buffer. For non-reducing conditions, 2-mercaptoethanol was excluded from the sample buffer described above. The sample was mixed with 5× sample buffer and incubated for 1 hour at room temperature. For heat-denaturation, samples were heated at 95 °C for 10 min unless indicated. For immunoblotting, proteins separated by SDS-PAGE were transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were blocked with TBS-T (TBS, 0.1% Triton X-100) containing 3% skim milk and then incubated with 1:1000 diluted antiserum in TBS-T containing 3% skim milk for 1 h at room temperature. After washing, the membranes were incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody (1:4000) for 30 min at room temperature and then washed thoroughly. The membranes were exposed to x-ray film (Fuji film) using ECL Western blotting detection reagent (Amersham Biosciences). Gel Filtration Chromatography Analysis of Adiponectin—Samples were filtered through 0.44-μm pore membranes and 200 μl were injected into a Superdex S300HR 10/30 (Amersham Biosciences) pre-equilibrated with PBS using the FPLC system (Amersham Biosciences) at 4 °C. Samples were eluted with PBS at a rate of 0.5 ml/min and monitored by absorbance at 280 nm. Fractions (0.5 ml) were collected. Analysis of Adiponectin from Human or Mouse Serum and Medium of 3T3-L1 Adipocytes—Freshly drawn human or mouse blood was coagulated for 30 min at room temperature. After centrifugation, 0.7 μl of the supernatant was diluted into non-reducing sample buffer and subjected to SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated into mature adipocytes for 10 days and washed twice in DMEM without serum. Adiponectin was allowed to secrete into DMEM without serum for 48 h and 10-μl aliquots were diluted into non-reducing sample buffer and subjected to SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. For an analysis of serum of human subjects heterozygous for G90S mutation, subjects are identified through screening of 1373 French Caucasians (16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Subjects ranging from 40 to 69 of age were selected and examined. Average age ± S.E. of these groups were 56.4 ± 7.9 (wild-type female), 54.7 ± 1.7 (G90S female), 59.4 ± 4.2 (wild-type male), 52.3 ± 2.9 (G90S male). Phosphorylation of AMPK and ACC by Adiponectin—The AMPK pathway was analyzed according to Ref. 23Yamauchi T. Kamon J. Minokoshi Y. Ito Y. Waki H. Uchida S. Yamashita S. Noda M. Kita S. Ueki K. Eto K. Akanuma Y. Froguel P. Foufelle F. Ferre P. Carling D. Kimura S. Nagai R. Kahn B.B. Kadowaki T. Nat. Med. 2002; 8: 1288-1295Crossref PubMed Scopus (3419) Google Scholar. Briefly, after cells had been incubated in serum-free RPMI 1640 medium (Sigma) for 6 h, RPMI 1640 containing E. coli recombinant adiponectin was added to the well and incubated for 5 min at 37 °C. The reaction was stopped with liquid nitrogen and cells were lysed and homogenized by a sonicator in lysis buffer (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 10 mm Na3VO4, 10 mm sodium pyrophosphate, 100 mm NaF, 10 mm EDTA, 10 mm EGTA, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Nonidet P-40). The lysate was centrifuged and the protein concentration was assayed using BCA protein assay reagent (Pierce). The same amount of lysate protein was applied to SDS-PAGE under reducing and heat-denaturing conditions, blotted onto PVDF membranes and immunostained with anti-phosphorylated AMPK antibodies or anti-phosphorylated ACC antibodies. NIH-Image was used for band quantification. SDS-PAGE under Non-reducing and Non-heat-denaturing Conditions Separates Multimer Species of Adiponectin—Adiponectin was reported to form several different molecular weight multimers by gel filtration and velocity gradient studies (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). When human and mouse adiponectin from serum or adipocytes, and recombinant adiponectin expressed in mammalian cells, were separated by SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions, three different molecular mass species (∼67, 136, and >300 kDa) of adiponectin were detected in all preparations (Fig. 1A). We designated these species as LMW (low molecular weight), MMW (middle molecular weight), and HMW (high molecular weight) multimers, respectively. In order to demonstrate these three species seen in Fig. 1A represent different multimer species, we subjected adiponectin to gel filtration analysis in parallel. Purified mouse adiponectin expressed in NIH-3T3 resolved into three peaks in gel filtration as reported before (Fig. 1B) (21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). SDS-PAGE analysis of each fraction revealed that these three peaks represented HMW, MMW, and LMW multimers (Fig. 1C). Adiponectin in human serum and adiponectin expressed in E. coli also had three peaks, which corresponded to HMW, MMW and LMW multimers (Fig. 1D). Fig. 1, E and F are examples showing adiponectin multimer distribution in serum of representative female and male human subjects. Both non-reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE (Fig. 1E) and gel filtration analysis (Fig. 1F) clearly demonstrated that the levels of HMW multimers were high in a female subject and low in a male subject. These data suggested that non-reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE was able to represent different adiponectin multimers as accurately as the conventional gel filtration analysis. Our SDS-PAGE analysis was superior to the gel filtration analysis in terms of resolving power. SDS-PAGE was able to clearly separate each of multimer species (Fig. 1E), whereas gel filtration did not completely separate each multimers (Fig. 1F). We also noted that there were several HMW species, whereas murine adiponectin had only one (Fig. 1A). These species were not recognized by conventional gel filtration analysis (Fig. 1F). Total adiponectin concentrations are known to be higher in females than in males (5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar). HMW multimers, but not MMW and LMW multimers, were significantly less abundant in male subjects than in female subjects (Fig. 1, E and F and Table I). This suggested that not only total adiponectin concentration but also multimer distribution are different in two genders.Table IGender difference in the multimer formation of adiponectinFemaleMaleHMW100 ± 1929.0 ± 14ap < 0.05 (Student's t-test) values of the same multimer species were compared between genders.MMW100 ± 6.981.5 ± 5.2LMW100 ± 1284.0 ± 6.6a p < 0.05 (Student's t-test) values of the same multimer species were compared between genders. Open table in a new tab Influence of Reduction and Heat Denaturation on Adiponectin Multimer Formation—When adiponectin expressed in NIH-3T3 or serum adiponectin were electrophoresed after reduction and heat denaturation, all molecular mass species were converted to a single 28-kDa band, indicating all of these species to be composed of identical monomers, namely, homomultimers (Fig. 2, A and B, lane 4). 56- and 28-kDa bands were seen, when the sample was heat-denatured under non-reducing conditions, suggesting the 56-kDa band to be a dimer (Fig. 2, A and B, lane 2). On the other hand, reduction without heat denaturation converted all of the molecular mass species to a 67-kDa band, which was the smallest molecular weight component of adiponectin, that is, a LMW multimer (Fig. 2, A and B, lane 3). This 67-kDa band was deduced to represent a trimer because the collagen-like structure and the globular domain of adiponectin are known to form a trimer (17Shapiro L. Scherer P.E. Curr. Biol. 1998; 8: 335-338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). To prove the 67-kDa band to be a trimer, we co-expressed amino-terminally truncated adiponectin (ΔH) and full-length wild-type adiponectin (WT). Two heterogeneous bands were observed when samples were separated by reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE (Fig. 3A, lane 4). These data suggested that the 67-kDa band (Fig. 3A, lane 2, Fig. 2, A and B, lane 3) was a trimer, and the two heterogeneous bands (Fig. 3A, lane 4) were heterotrimers (i.e. WT x2/ΔH x1, WT x1/ΔH x2). The size of 67 kDa, w

The adipocyte-derived hormone adiponectin has been shown to play important roles in the regulation of energy homeostasis and insulin sensitivity. In this study, we analyzed globular domain adiponectin (gAd) transgenic (Tg) mice crossed with leptin-deficient ob/ob or apoE-deficient mice. Interestingly, despite an unexpected similar body weight, gAd Tg ob/ob mice showed amelioration of insulin resistance and β-cell degranulation as well as diabetes, indicating that globular adiponectin and leptin appeared to have both distinct and overlapping functions. Amelioration of diabetes and insulin resistance was associated with increased expression of molecules involved in fatty acid oxidation such as acyl-CoA oxidase, and molecules involved in energy dissipation such as uncoupling proteins 2 and 3 and increased fatty acid oxidation in skeletal muscle of gAd Tg ob/ob mice. Moreover, despite similar plasma glucose and lipid levels on an apoE-deficient background, gAd Tg apoE-deficient mice showed amelioration of atherosclerosis, which was associated with decreased expression of class A scavenger receptor and tumor necrosis factor α. This is the first demonstration that globular adiponectin can protect against atherosclerosis in vivo. In conclusion, replenishment of globular adiponectin may provide a novel treatment modality for both type 2 diabetes and atherosclerosis.

Background & Aims: Epidemiological studies have suggested a linkage between type 2 diabetes and chronic hepatitis C virus (HCV) infection. However, the presence of additional factors such as obesity, aging, or cirrhosis prevents the establishment of a definite relationship between these 2 conditions. Methods: A mouse model transgenic for the HCV core gene was used. Results: In the glucose tolerance test, plasma glucose levels were higher at all time points including in the fasting state in the core gene transgenic mice than in control mice, although the difference was not statistically significant. In contrast, the transgenic mice exhibited a marked insulin resistance as revealed by the insulin tolerance test, as well as significantly higher basal serum insulin levels. Feeding with a high-fat diet led to the development of overt diabetes in the transgenic mice but not in control mice. A high level of tumor necrosis factor-α, which has been also observed in human chronic hepatitis C patients, was considered to be one of the bases of insulin resistance in the transgenic mice, which acts by disturbing tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1. Moreover, administration of an anti-tumor necrosis factor-α antibody restored insulin sensitivity. Conclusions: The ability of insulin to lower the plasma glucose level in the HCV transgenic mice was impaired, as observed in chronic hepatitis C patients. These results provide a direct experimental evidence for the contribution of HCV in the development of insulin resistance in human HCV infection, which finally leads to the development of type 2 diabetes.

A new catalytic oxidation using 2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxyl (TEMPO) and NaClO is applied to hardwood cellulose in water at 60 °C and pH 6.8 with NaClO2 used as a primary oxidant. The oxidized celluloses with carboxylate content of approximately 0.8 mmol/g were convertible to highly crystalline and individual fibrils 5 nm in width and at least 2 μm in length by disintegration in water. The oxidized celluloses had no aldehyde groups, and high degrees of polymerization of more than 900. Solid-state 13C NMR and X-ray analyses revealed that the C6 carboxylate groups formed are selectively present on the crystalline fibril surfaces at high densities. Films prepared from the dispersions were transparent and flexible, and exhibited a high tensile strength of 312 MPa even at a low density of 1.47 g/cm3.

Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ is a ligand-activated transcription factor and a member of the nuclear hormone receptor superfamily that is thought to be the master regulator of fat storage; however, the relationship between PPARγ and insulin sensitivity is highly controversial. We show here that supraphysiological activation of PPARγ by PPARγ agonist thiazolidinediones (TZD) markedly increases triglyceride (TG) content of white adipose tissue (WAT), thereby decreasing TG content of liver and muscle, leading to amelioration of insulin resistance at the expense of obesity. Moderate reduction of PPARγ activity by heterozygous PPARγ deficiency decreases TG content of WAT, skeletal muscle, and liver due to increased leptin expression and increase in fatty acid combustion and decrease in lipogenesis, thereby ameliorating high fat diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover, although heterozygous PPARγ deficiency and TZD have opposite effects on total WAT mass, heterozygous PPARγ deficiency decreases lipogenesis in WAT, whereas TZD stimulate adipocyte differentiation and apoptosis, thereby both preventing adipocyte hypertrophy, which is associated with alleviation of insulin resistance presumably due to decreases in free fatty acids, and tumor necrosis factor α, and up-regulation of adiponectin, at least in part. We conclude that, although by different mechanisms, both heterozygous PPARγ deficiency and PPARγ agonist improve insulin resistance, which is associated with decreased TG content of muscle/liver and prevention of adipocyte hypertrophy. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ is a ligand-activated transcription factor and a member of the nuclear hormone receptor superfamily that is thought to be the master regulator of fat storage; however, the relationship between PPARγ and insulin sensitivity is highly controversial. We show here that supraphysiological activation of PPARγ by PPARγ agonist thiazolidinediones (TZD) markedly increases triglyceride (TG) content of white adipose tissue (WAT), thereby decreasing TG content of liver and muscle, leading to amelioration of insulin resistance at the expense of obesity. Moderate reduction of PPARγ activity by heterozygous PPARγ deficiency decreases TG content of WAT, skeletal muscle, and liver due to increased leptin expression and increase in fatty acid combustion and decrease in lipogenesis, thereby ameliorating high fat diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover, although heterozygous PPARγ deficiency and TZD have opposite effects on total WAT mass, heterozygous PPARγ deficiency decreases lipogenesis in WAT, whereas TZD stimulate adipocyte differentiation and apoptosis, thereby both preventing adipocyte hypertrophy, which is associated with alleviation of insulin resistance presumably due to decreases in free fatty acids, and tumor necrosis factor α, and up-regulation of adiponectin, at least in part. We conclude that, although by different mechanisms, both heterozygous PPARγ deficiency and PPARγ agonist improve insulin resistance, which is associated with decreased TG content of muscle/liver and prevention of adipocyte hypertrophy. peroxisome proliferator-activated receptor white adipose tissue triglyceride thiazolidinediones retinoid X receptor free fatty acids tumor necrosis factor high carbohydrate sterol regulatory element-binding protein insulin receptor substrate high fat phosphatidylinositol brown adipose tissue Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)1 γ is a ligand-activated transcription factor and a member of the nuclear hormone receptor superfamily that functions as a heterodimer with a retinoid X receptor (RXR) (1Kersten S. Desvergne B. Wahli W. Nature. 2000; 405: 421-424Crossref PubMed Scopus (1701) Google Scholar, 2Spiegelman B.M. Flier J.S. Cell. 1996; 87: 377-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1175) Google Scholar, 3Gonzalez F.J. Biochimie (Paris). 1997; 79: 139-144Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar, 4Auwerx J. Diabetologia. 1999; 42: 1033-1049Crossref PubMed Scopus (587) Google Scholar, 5Saltiel A.R. Olefsky J.M. Diabetes. 1996; 45: 1661-1669Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar). Agonist-induced activation of PPARγ/RXR is known to increase insulin sensitivity (6Lehmann J.M. Moore L.B. Smith-Oliver T.A. Wilkison W.O. Willson T.M. Kliewer S.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 12953-12956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3492) Google Scholar, 7Mukherjee R. Davies P.J. Crombie D.L. Bischoff E.D. Cesario R.M. Jow L. Hamann L.G. Boehm M.F. Mondon C.E. Nadzan A.M. Paterniti Jr., J.R. Heyman R.A. Nature. 1997; 386: 407-410Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar). Thiazolidinediones (TZD), which have the ability to directly bind and activate PPARγ (6Lehmann J.M. Moore L.B. Smith-Oliver T.A. Wilkison W.O. Willson T.M. Kliewer S.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 12953-12956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3492) Google Scholar) and to stimulate adipocyte differentiation (2Spiegelman B.M. Flier J.S. Cell. 1996; 87: 377-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1175) Google Scholar, 8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar), are used clinically to reduce insulin resistance and hyperglycemia in type 2 diabetes (1Kersten S. Desvergne B. Wahli W. Nature. 2000; 405: 421-424Crossref PubMed Scopus (1701) Google Scholar, 2Spiegelman B.M. Flier J.S. Cell. 1996; 87: 377-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1175) Google Scholar, 4Auwerx J. Diabetologia. 1999; 42: 1033-1049Crossref PubMed Scopus (587) Google Scholar, 5Saltiel A.R. Olefsky J.M. Diabetes. 1996; 45: 1661-1669Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar). We and others (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar, 10Miles P.D. Barak Y. He W. Evans R.M. Olefsky J.M. J. Clin. Invest. 2000; 105: 287-292Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar) have reported that heterozygous PPARγ-deficient mice are protected from high fat (HF) diet- or aging-induced adipocyte hypertrophy, obesity, and insulin resistance. Consistent with this, the Pro-12 → Ala polymorphism in human PPARγ2, which moderately reduces the transcriptional activity of PPARγ, has been shown to confer resistance to type 2 diabetes (11Deeb S.S. Fajas L. Nemoto M. Pihlajamaki J. Mykkanen L. Kuusisto J. Laakso M. Fujimoto W. Auwerx J. Nat. Genet. 1998; 3: 284-287Crossref Scopus (1225) Google Scholar, 12Hara K. Okada T. Tobe K. Yasuda K. Mori Y. Kadowaki H. Hagura R. Akanuma Y. Kimura S. Ito C. Kadowaki T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 271: 212-216Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 13Altshuler D. Hirschhorn J.N. Klannemark M. Lindgren C.M. Vohl M.C. Nemesh J. Lane C.R. Schaffner S.F. Bolk S. Brewer C. Tuomi T. Gaudet D. Hudson T.J. Daly M. Groop L. Lander E.S. Nat. Genet. 2000; 26: 76-80Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar). This apparent paradox raises the following important unresolved issue (14Kahn R.C. Chen L. Cohen S.E. J. Clin. Invest. 2000; 106: 1305-1307Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar) which we addressed experimentally in this study. We attempted to explain how insulin resistance could be improved by two opposite PPARγ activity states, supraphysiological activation of PPARγ and moderate reduction. We did so by using heterozygous PPARγ-deficient mice and a pharmacological activator of PPARγ in wild-type mice. We show here that supraphysiological activation of PPARγ by TZD markedly increases triglyceride (TG) content of white adipose tissue (WAT), thereby decreasing TG content of liver and muscle, leading to amelioration of insulin resistance at the expense of obesity. Moderate reduction of PPARγ activity by heterozygous PPARγ deficiency decreases TG content of WAT, skeletal muscle, and liver due to increased leptin expression and increase in fatty acid combustion and decrease in lipogenesis, thereby ameliorating HF diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover, although heterozygous PPARγ deficiency and TZD have opposite effects on total WAT mass, heterozygous PPARγ deficiency decreases lipogenesis in WAT, whereas TZD stimulate adipocyte differentiation and apoptosis, thereby both preventing adipocyte hypertrophy. This results in a decrease in molecules causing insulin resistance such as free fatty acids (FFA) (15Shulman G.I. J. Clin. Invest. 2000; 106: 171-176Crossref PubMed Scopus (2220) Google Scholar) and tumor necrosis factor (TNF) α (16Hotamisligil G.S. J. Intern. Med. 1999; 245: 621-625Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar) and up-regulation of insulin-sensitizing hormone adiponectin (17Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4165) Google Scholar), thereby leading to alleviation of insulin resistance. We conclude that, although by different mechanisms, both heterozygous PPARγ deficiency and PPARγ agonist improve insulin resistance, which is associated with decreased TG content of muscle/liver and prevention of adipocyte hypertrophy. Rosiglitazone was synthesized as described elsewhere (6Lehmann J.M. Moore L.B. Smith-Oliver T.A. Wilkison W.O. Willson T.M. Kliewer S.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 12953-12956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3492) Google Scholar). Wy-14,643 was purchased from Biomol (Plymouth Meeting, PA). All other materials were from the sources given in Refs. 8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar and9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar. Heterozygous PPARγ-deficient mice have been described (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). All other animals were purchased from Nippon CREA Co., Ltd. Six-week-old mice were fed powdered chow according to methods described previously (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). Drugs were given as food admixtures (8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar, 9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar), and there was no toxicity observed including liver damage. The area of glucose and insulin curves was calculated by multiplying the cumulative mean height of the glucose values (1 mg ml−1 = 1 cm) and insulin values (1 ng ml−1 = 1 cm), respectively, by time (60 min = 1 cm) as described in Ref. 7Mukherjee R. Davies P.J. Crombie D.L. Bischoff E.D. Cesario R.M. Jow L. Hamann L.G. Boehm M.F. Mondon C.E. Nadzan A.M. Paterniti Jr., J.R. Heyman R.A. Nature. 1997; 386: 407-410Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar. The results are expressed as the percentage of the value of each controls. The insulin resistance index (7Mukherjee R. Davies P.J. Crombie D.L. Bischoff E.D. Cesario R.M. Jow L. Hamann L.G. Boehm M.F. Mondon C.E. Nadzan A.M. Paterniti Jr., J.R. Heyman R.A. Nature. 1997; 386: 407-410Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar) was calculated from the product of the areas of glucose and insulin × 10−2 in glucose tolerance test (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). The results are expressed as the ratio of the value of each wild-type controls on the high carbohydrate (HC) diet (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). Leptin was assayed with the enzyme-linked immunosorbent assay-based Quantikine M mouse leptin immunoassay kit (R & D Systems) according to the manufacturer's instructions. For leptin sensitivity (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar), leptin (PeproTech) was administered to mice as a daily intraperitoneal injection of 10 µg/g body weight/day. Isotonic sodium chloride solution was administered to the controls. Food intake and body weight were measured to assess the effects of leptin administration. Adipose tissue was removed from each animal, fixed in 10% formaldehyde/phosphate-buffered saline, and maintained at 4 °C until used. Fixed specimens were dehydrated, embedded in tissue-freezing medium (Tissue-Tek OCT compound; Miles), and frozen in dry ice and acetone. WAT was cut into 10-µm sections, and the sections were mounted on silanized slides. The adipose tissue was stained with hematoxylin and eosin. Mature white adipocytes were identified by their characteristic multilocular appearance. Total adipocyte areas were traced manually and analyzed with Win ROOF software (Mitani Co., Ltd., Chiba, Japan). White adipocyte areas were measured in 400 or more cells per mouse in each group according to the methods described previously (8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar, 9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). Sections of adipose tissues from mice treated for 14 days were stained by the terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end-labeling technique with a kit (In Situ Cell Death Detection Kit, AP; Roche Molecular Biochemicals) to detect apoptotic nuclei as described (8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar), with slight modifications. The numbers of all nuclei and apoptosis positive-stained nuclei were counted to calculate the ratio to the number of apoptotic nuclei to total number of nuclei. Total RNA was prepared from tissues with TRIzol (Life Technologies, Inc.) according to the manufacturer's instructions. Total RNA from 5 to 10 mice in each group was pooled, and aliquots were subjected to Northern blot analysis with the probes for rat acyl-CoA oxidase (Dr. T. Hashimoto), mouse CD36, UCP2, and adiponectin cDNA or RNase protection assay to measure mRNAs of TNFα performed using a standard protocol (8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar, 9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar, 18Murakami K. Tobe K. Ide T. Mochizuki T. Ohashi M. Akanuma Y. Yazaki Y. Kadowaki T. Diabetes. 1998; 47: 1841-1847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar, 19Motojima K. Passilly P. Peters J.M. Gonzalez F.J. Latruffe N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16710-16714Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar). The radioactivity in each band was quantified, and the fold change in each mRNA was calculated after correction for loading differences by measuring the amount of 28 S rRNA. Very low levels (<10%) of adipocyte P2 mRNA were detected in muscle as compared with those in WAT. By contrast, CD36, SCD1, acyl-CoA oxidase, and UCP2 mRNAs were detected in muscle at levels comparable to those in WAT. These findings suggest that the results for muscle tissue essentially represent the results for the muscle cells, although the muscle was contaminated by a small amount (<10%) of inter-myocyte fat (20Vidal-Puig A. Jimenez-Linan M. Lowell B.B. Hamann A. Hu E. Spiegelman B. Flier J.S. Moller D.E. J. Clin. Invest. 1996; 97: 2553-2561Crossref PubMed Scopus (598) Google Scholar). The procedures used for PI3-kinase assay, immunoprecipitation, and immunoblotting have been described previously (21Yamauchi T. Tobe K. Tamemoto H. Ueki K. Kaburagi Y. Yamamoto-Honda R. Takahashi Y. Yoshizawa F. Aizawa S. Akanuma Y. Sonenberg N. Yazaki Y. Kadowaki T. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 3074-3084Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar). Representative data from one of three independent experiments are shown. The measurements of [14C]CO2 production from [1-14C]palmitic acid and lipogenesis from [1-14C]acetate were performed using liver, muscle, and WAT slices, as described (18Murakami K. Tobe K. Ide T. Mochizuki T. Ohashi M. Akanuma Y. Yazaki Y. Kadowaki T. Diabetes. 1998; 47: 1841-1847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar, 22Mannaerts G.P. Debeer L.J. Thomas J. De Schepper P.J. J. Biol. Chem. 1979; 254: 4585-4595Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Liver and muscle homogenates were extracted, and their TG content was determined as described previously (18Murakami K. Tobe K. Ide T. Mochizuki T. Ohashi M. Akanuma Y. Yazaki Y. Kadowaki T. Diabetes. 1998; 47: 1841-1847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar), with some modifications. To explain how insulin resistance could be improved by two opposite PPARγ activity states, supraphysiological activation of PPARγ and moderate reduction, we studied the phenotypes of untreated or PPARγ agonist-treated wild-type mice and untreated heterozygous PPARγ-deficient mice. We assessed PPARγ activity in vivoby measuring expression levels of lipoprotein lipase (23Schoonjans K. Peinado-Onsurbe J. Lefebvre A.M. Heyman R.A. Briggs M. Deeb S. Staels B. Auwerx J. EMBO J. 1996; 15: 5336-5348Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar), fatty-acid translocase (FAT)/CD36 (24Tontonoz P. Nagy L. Alvarez J.G. Thomazy V.A. Evans R.M. Cell. 1998; 93: 241-252Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1633) Google Scholar), and adipocyte fatty acid-binding protein/adipocyte P2 (25Tontonoz P. Hu E. Spiegelman B.M. Cell. 1994; 79: 1147-1156Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3175) Google Scholar) (Fig.1A), whose promoters contain peroxisome proliferator response element, in WAT, where PPARγ is expressed most predominantly in vivo. As expected, rosiglitazone-treated wild-type mice exhibited a significant increase in PPARγ activity as compared with untreated wild-type mice (Fig.1A, lanes 1 and 2), whereas untreated heterozygous PPARγ-deficient mice showed a moderate decrease in PPARγ activity (Fig. 1A, lanes 1 and3). Untreated wild-type mice on the HF diet gained significantly more body weight than the mice on the HC diet (data not shown). Administration of rosiglitazone to wild-type mice increased significantly more body weight than vehicle on the HF diet (Fig. 1B, lanes 1 and 2). In contrast, heterozygous PPARγ deficiency reduced the increase in body weight on the HF diet (Fig. 1B, lanes 2 and 3). Treatment of wild-type mice with rosiglitazone significantly increased WAT mass (Fig. 1C,lanes 1 and 2), whereas untreated heterozygous PPARγ-deficient mice were protected from HF diet-induced increase in WAT mass (Fig. 1C, lanes 2 and 3). These data suggested that PPARγ determines the adiposity in proportion to its activity. Treatment of wild-type mice with rosiglitazone improved hyperglycemia (Fig. 1D, lanes 1) and hyperinsulinemia (Fig.1E, lane 1) on the HF diet as compared with untreated wild-type mice (Fig. 1, D and E, lane 2). Untreated heterozygous PPARγ-deficient mice were also protected from HF diet-induced hyperglycemia (Fig. 1D, lanes 2 and 3) and hyperinsulinemia (Fig. 1E, lanes 2 and 3). These findings indicate that TZD improve insulin sensitivity at the expense of obesity, whereas moderate reduction of PPARγ activity has potential as anti-obesity and anti-diabetic drugs. The rectal temperature was lower in rosiglitazone-treated wild-type mice than that in untreated wild-type mice (Fig. 2A, lanes 1 and 2); on the contrary, it was significantly higher in untreated heterozygous PPARγ-deficient mice (Fig. 2A, lanes 2 and 3). The serum leptin (26Friedman J.M. Nature. 2000; 404: 632-634Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar) levels were slightly but not significantly lower in rosiglitazone-treated wild-type mice than those of untreated wild-type mice (Fig. 2B,lanes 1 and 2), whereas they were significantly higher in untreated heterozygous PPARγ-deficient mice (Fig.2B, lanes 2 and 3). Thus the serum leptin levels were parallel to the rectal temperature. It was also noted that serum leptin levels were negatively correlated with PPARγ activity, suggesting that the serum leptin levels were parallel to the repression of leptin gene transcription by PPARγ/RXR (27Hollenberg A.N. Susulic V.S. Madura J.P. Zhang B. Moller D.E. Tontonoz P. Sarraf P. Spiegelman B.M. Lowell B.B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 5283-5290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (233) Google Scholar). Moreover, leptin sensitivity as assessed by reductions in food intake and body weight change in response to exogenously administered leptin was significantly increased in heterozygous PPARγ-deficient mice as compared with wild-type mice on the HF diet (Fig. 2C andD, lanes 3–6). The degree of change in body weight induced by leptin treatment differed significantly (p < 0.01) between wild-type (−0.67 ± 0.09%) and heterozygous PPARγ-deficient mice (−1.38 ± 0.11%). These data raised the possibility that increased leptin effects may contribute to the effects of the heterozygous PPARγ deficiency. In WAT from untreated heterozygous PPARγ-deficient mice, expressions of lipoprotein lipase and CD36 were reduced, which may contribute to decreased TG content. In addition, expressions of lipogenic enzymes such as sterol regulatory element-binding protein (SREBP) 1c and SCD (stearoyl-CoA desaturase) 1 were reduced, and lipid synthesis was indeed significantly decreased in WAT from heterozygous PPARγ-deficient mice as compared with that in wild-type mice on the HF diet (Fig. 2F). Expression of β3-adrenergic receptor (Fig. 2E, lanes 2 and 3) was increased presumably due to their increased leptin effects (Fig. 2, B–D) (28Soukas A. Cohen P. Socci N.D. Friedman J.M. Genes Dev. 2000; 14: 963-980PubMed Google Scholar) and decreased PPARγ/RXR effects (29Bakopanos E. Silva J.E. Diabetes. 2000; 49: 2108-2115Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar), and fatty acid oxidation was increased (data not shown). Decreased lipid synthesis and increased fatty acid oxidation as well as presumably decreased fatty acid influx in heterozygous PPARγ-deficient mice may in concert prevent adipocyte hypertrophy (Fig. 3A), and therefore obesity (Fig. 1, B and C, lanes 2 and 3), on the HF diet. Interestingly, supraphysiological activation of PPARγ significantly reduced the average size of adipocytes under the HF diet (Fig.3A, lane 1 and 2) as a result of a marked increase in the number of newly differentiated small adipocytes and significant decrease in the number of large adipocytes with a concomitant induction of apoptosis of adipocyte (Fig. 3B, lanes 1 and 2, and Fig. 3C) (8Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (937) Google Scholar). On the other hand, heterozygous PPARγ deficiency appeared to prevent HF diet-induced adipocyte hypertrophy without a significant change in the total number of adipocytes (Fig. 3B, lanes 2 and3 and Fig. 3C). These data suggest that the heterozygous PPARγ deficiency decreases lipogenesis in WAT, whereas TZD stimulate adipocyte differentiation and apoptosis, thereby both preventing adipocyte hypertrophy. We next attempted to experimentally clarify the relationships between adipocyte hypertrophy and insulin resistance. To this end, we induced adipocyte hypertrophy by high fat feeding, leptin receptor deficiency, or agouti overexpression. The size of the adipose cells and the insulin resistance were increased in mice on a HF diet compared with those in mice on a HC diet (Fig. 3D). The size of the adipose cells and the insulin resistance of db/db mice were also increased compared with their wild-type controls on both the HC and HF diet (Fig. 3D). We obtained essentially similar results by using KKAy mice and their wild-type controls (KK) (Fig. 3E). These findings support a close correlation between adipocyte hypertrophy and insulin resistance, even though a cause and effect relationship is again unproven. In this context, protection from adipocyte hypertrophy due to decreased lipid synthesis in WAT from heterozygous PPARγ-deficient mice (Fig. 2F) may cause an increase in insulin sensitivity (Fig. 3F). We tried to clarify the molecular link between adipocyte hypertrophy and insulin resistance. We examined the levels of expression of molecules secreted by WAT that regulate insulin sensitivity under the following four different conditions: HC feeding, HF feeding, HF feeding with heterozygous PPARγ deficiency, and HF feeding with PPARγ agonist. The HF diet significantly increased adipocyte size and at the same time increased the molecules causing insulin resistance, such as FFA and TNFα (Fig. 3,G and H), and decreased the molecules causing insulin sensitivity, such as adiponectin (Fig. 3I), in mice that exhibited insulin resistance as compared with mice on the HC diet (Fig. 1, D and E, lanes 1 and2). (Replenishment of adiponectin in KKAy mice on the HF diet partially reverses insulin resistance even at the doses that do not significantly change adipocyte size (17Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4165) Google Scholar).) In addition, treatment of wild-type mice with the PPARγ agonist rosiglitazone or heterozygous PPARγ deficiency, both of which resulted in protection against HF diet-induced adipocyte hypertrophy, significantly decreased FFA and TNFα (Fig. 3, G and H) and increased adiponectin (Fig. 3I) and at the same time ameliorated insulin resistance (Fig. 1, D and E) on the HF diet. However, treatment of wild-type mice with a PPARγ agonist increased adipose tissue mass (Fig. 1C, lane 1) and body weight (Fig. 1B, lane 1), whereas heterozygous PPARγ deficiency significantly decreased them (Fig. 1,B and C, lane 3). These findings raised the possibility that levels of expression of molecules regulating insulin sensitivity may be more closely related to adipocyte size than PPARγ activity, adipose tissue mass, or body weightin vivo. Large adipocytes are known to be resistant to anti-lipolytic action of insulin, thereby releasing a large amount of FFA (30Askew E.W. Huston R.L. Plopper C.G. Hecker A.L. J. Clin. Invest. 1975; 56: 521-529Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar); however, the mechanisms underlying the correlation between larger adipocytes and up-regulation of TNFα and/or down-regulation of adiponectin remain to be elucidated. Interestingly, both supraphysiological activation of PPARγ and moderate reduction of PPARγ activity significantly reduced tissue TG content in muscle and liver (Fig.4A and Fig.5A), suggesting that insulin resistance has an excellent correlation with tissue TG content in muscle and liver (Fig. 1, D and E, Fig.4A, and Fig. 5A) (15Shulman G.I. J. Clin. Invest. 2000; 106: 171-176Crossref PubMed Scopus (2220) Google Scholar).Figure 5TZDindirectly decreases molecules involved inFFAinflux into the liver, whereas heterozygous PPARγ deficiency combusts fatty acid and decreases lipogenesis, thereby both decreasing tissueTGcontent in liver. Tissue triglyceride (A), amounts of the mRNAs of fatty-acid translocase (FAT)/CD36, SREBP 1, stearoyl Co-A desaturase (SCD) 1, acyl-CoA oxidase (ACO), and uncoupling protein (UCP) 2 (B), lipid synthesis from [14C]acetate in the liver (C), fatty acid (FA) oxidation (D), glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) (E), in liver of wild-type (WT) and heterozygous PPARγ-deficient mice (+/−) untreated (−) or treated with rosiglitazone (Rosi) for 4 weeks while on the HF diet. Rosiglitazone was given as a 0.01% food admixture. Fatty acid oxidation was assessed by the measurements of [14C]CO2 production from [14C]palmitic acid (D). Each bar represents the mean ± S.E. (n = 5–10). *, p< 0.05; **, p < 0.01; compared with untreated wild-type mice.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) In wild-type mice treated with rosiglitazone, the decreased tissue TG content in muscle/liver, where PPARγ was less abundantly expressed as compared with what was in WAT, was presumably via reduced expression of molecules involved in FFA influx into muscle/liver (Fig. 4Eand Fig. 5B, lanes 1 and 2). On the other hand, heterozygous PPARγ deficiency reduced expression of lipogenic enzymes such as SCD1 (Fig. 4E and Fig. 5B, lanes 2 and 3) and SREBP 1 (Fig.5B, lanes 2 and 3), and indeed significantly reduced lipogenesis (Fig. 5C), presumably due to increased leptin effects (Fig. 2, B–D) (28Soukas A. Cohen P. Socci N.D. Friedman J.M. Genes Dev. 2000; 14: 963-980PubMed Google Scholar), may reduce tissue TG content in muscle/liver (Fig. 4A and Fig.5A, lanes 2 and 3). Moreover, in muscle/liver from heterozygous PPARγ-deficient mice, increased expression of enzymes involved in β-oxidation such as acyl-CoA oxidase and that of molecules involved in energy dissipation such as UCP2 (Fig. 4E and Fig.5B, lanes 2 and 3) were observed. Fatty acid oxidation was indeed significantly increased in muscle/liver from heterozygous PPARγ-deficient mice as compared with that in wild-type mice on the HF diet (Fig. 4F and Fig.5D). These alterations may be an additional mechanism for reduced TG content in muscle/liver of heterozygous PPARγ-deficient mice. Since these effects were recapitulated by treatment of wild-type mice with Wy-14,643, a PPARα agonist as reported (18Murakami K. Tobe K. Ide T. Mochizuki T. Ohashi M. Akanuma Y. Yazaki Y. Kadowaki T. Diabetes. 1998; 47: 1841-1847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar, 19Motojima K. Passilly P. Peters J.M. Gonzalez F.J. Latruffe N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16710-16714Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar, 31Kelly L.J. Vicario P.P. Thompson G.M. Candelore M.R. Doebber T.W. Ventre J. Wu M.S. Meurer R. Forrest M.J. Conner M.W. Cascier I.M.A. Moller D.E. Endocrinology. 1998; 139: 4920-4927Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar) (data not shown), PPARα pathways appeared to be activated in the liver of heterozygous PPARγ-deficient mice. In the BAT, where PPARα was relatively abundantly expressed compared to that in WAT, significant increases in the expression of molecules involved in fatty acid combustion presumably via activation of PPARα pathways (18Murakami K. Tobe K. Ide T. Mochizuki T. Ohashi M. Akanuma Y. Yazaki Y. Kadowaki T. Diabetes. 1998; 47: 1841-1847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar, 19Motojima K. Passilly P. Peters J.M. Gonzalez F.J. Latruffe N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16710-16714Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar, 31Kelly L.J. Vicario P.P. Thompson G.M. Candelore M.R. Doebber T.W. Ventre J. Wu M.S. Meurer R. Forrest M.J. Conner M.W. Cascier I.M.A. Moller D.E. Endocrinology. 1998; 139: 4920-4927Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar) and β3-adrenergic receptor (Fig. 6), due to increased leptin effects (28Soukas A. Cohen P. Socci N.D. Friedman J.M. Genes Dev. 2000; 14: 963-980PubMed Google Scholar) and decreased PPARγ effects (29Bakopanos E. Silva J.E. Diabetes. 2000; 49: 2108-2115Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar), were observed. These alterations in concert may provide the mechanism that increased energy expenditure by heterozygous PPARγ deficiency (Fig.2A). Increased tissue TG content has been reported to interfere with insulin-stimulated phosphatidylinositol (PI) 3-kinase activation and subsequent GLUT4 translocation and glucose uptake (15Shulman G.I. J. Clin. Invest. 2000; 106: 171-176Crossref PubMed Scopus (2220) Google Scholar). Next, we tried to experimentally clarify the relationships between tissue TG content and insulin resistance. To do so, we increased tissue TG content by high fat feeding, leptin receptor deficiency, or agouti overexpression. The tissue TG content of skeletal muscle and insulin resistance were increased in mice on the HF diet compared with those in mice on the HC diet (Fig. 4B). The tissue TG content of skeletal muscle and insulin resistance of db/db mice were also increased compared with their wild-type controls on both the HC and HF diets (Fig.4B). We obtained essentially similar results by using KKAy mice and their wild-type controls (KK) (Fig. 4C). These findings raise the possibility that increases in tissue TG content are associated with insulin resistance. Conversely, decreased tissue TG content due to decreased lipid synthesis and increased fatty acid oxidation in muscle/liver from heterozygous PPARγ-deficient mice (Fig. 4F and Fig. 5, C and D) may cause an increase in insulin sensitivity (Fig. 4D). Shulman and co-workers (32Abel E.D. Peroni O. Kim J.K. Kim Y.B. Boss O. Hadro E. Minnemann T. Shulman G.I. Kahn B.B. Nature. 2001; 409: 729-733Crossref PubMed Scopus (983) Google Scholar) proposed a cause and effect relationship between the accumulation of intracellular fatty acid-derived metabolites and insulin resistance. However, there are instances in which tissue TG content actually does not change in another scenario that also causes insulin resistance, i.e. adipose-selective targeting of the GLUT4 gene (32Abel E.D. Peroni O. Kim J.K. Kim Y.B. Boss O. Hadro E. Minnemann T. Shulman G.I. Kahn B.B. Nature. 2001; 409: 729-733Crossref PubMed Scopus (983) Google Scholar). Thus, interpretation should be done with caution, and decreased tissue TG content in muscle/liver is one possible mechanism for the results of increased insulin sensitivity in heterozygous PPARγ-deficient mice. Consistent with this possibility, decreased TG content in muscle of heterozygous PPARγ-deficient mice indeed improved insulin signal transduction in muscle, as demonstrated by increases in insulin-induced tyrosine phosphorylation of insulin receptor, insulin receptor substrate (IRS)-1 and IRS-2, and insulin-stimulated PI3-kinase activity in phosphotyrosine, IRS-1 and IRS-2 immunoprecipitates, and insulin-stimulated Akt activity in skeletal muscle (Fig.4G). The reduction of TG content in liver of heterozygous PPARγ-deficient mice was associated with increased expression of glucokinase and decreased expression of enzymes involved in gluconeogenesis such as phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase (Fig. 5E), indicating increased insulin actions also in liver. We attempted to explain how insulin resistance could be improved by the following two opposite PPARγ activity states: a potent activation of PPARγ and its moderate reduction. We did so by using heterozygous PPARγ-deficient mice and a pharmacological activator of PPARγ in wild-type mice. On the basis of experimental results obtained in this study, we propose the following hypothesis on the mechanisms for the regulation of insulin sensitivity by PPARγ (Fig.7). As shown in the Fig. 7, panel 2, on the HF diet, “normal” amounts of PPARγ activity seen in wild-type mice increase TG content in WAT, skeletal muscle, and liver due to a combination of increased fatty acid influx into WAT, skeletal muscle, and liver and HF diet-induced leptin resistance, leading to insulin resistance and obesity. Moreover, hypertrophic adipocytes may increase the secretion of molecules causing insulin resistance, such as FFA (15Shulman G.I. J. Clin. Invest. 2000; 106: 171-176Crossref PubMed Scopus (2220) Google Scholar) and TNFα (16Hotamisligil G.S. J. Intern. Med. 1999; 245: 621-625Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar), and decrease that of an insulin-sensitizing hormone, such as adiponectin (17Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4165) Google Scholar). As shown in Fig. 7, panel 1, supraphysiological activation of PPARγ way beyond that by TZD stimulates adipogenesis, which promotes a flux of FFA from liver and muscle into WAT, leading to a decrease in TG content in liver and muscle and improvement of insulin sensitivity at the expense of increased WAT mass, i.e.obesity. Moreover, TZD induce adipocyte differentiation and apoptosis, thereby increasing the number of small adipocytes, which finally lead to alleviation of insulin resistance presumably via a decrease in molecules causing insulin resistance, such as FFA and TNFα, and up-regulation of insulin-sensitizing hormone adiponectin, at least in part. By contrast, as shown in the Fig. 7, panel 3, moderate reduction of PPARγ activity observed in untreated heterozygous PPARγ-deficient mice decreases TG content in WAT, skeletal muscle, and liver. This effect is due to a combination of increased leptin expression by antagonism of PPARγ-mediated suppression of the gene, thereby reducing expression of lipogenic enzymes, and consequent activation of PPARα pathway in liver, BAT, and skeletal muscle, leading to an increase in expression of UCP2 and enzymes involved in β-oxidation. These observations fit well with the recently demonstrated effects of PPARα agonists on insulin resistance (33Guerre-Millo M. Gervois P. Raspe E. Madsen L. Poulain P. Derudas B. Herbert J.M. Winegar D.A. Willson T.M. Fruchart J.C. J. Biol. Chem. 2000; 275: 16638-16642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (551) Google Scholar) and decreased fatty acid combustion in PPARα-deficient mice (34Kersten S. Seydoux J. Peters J.M. Gonzalez F.J. Desvergne B. Wahli W. J. Clin. Invest. 1999; 103: 1489-1498Crossref PubMed Scopus (1390) Google Scholar). Moreover, direct antagonism of PPARγ to reduce lipogenesis in WAT prevents adipocyte hypertrophy under the HF diet, thereby reducing the molecules causing insulin resistance, such as FFA and TNFα, and up-regulating the insulin-sensitizing hormone adiponectin, at least in part. These alterations lead to prevention against HF diet-induced obesity and insulin resistance. The data showing that moderate reduction of PPARγ activity resulted in increased insulin sensitivity were further confirmed by the observation that treatment of heterozygous PPARγ-deficient mice with a low dose of TZD caused the re-emergence of insulin resistance (9Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1243) Google Scholar). This study has thus revealed the mechanisms whereby both PPARγ agonist and heterozygous PPARγ deficiency have a similar effect on insulin sensitivity. However, it should also be noted that PPARγ agonist and heterozygous PPARγ deficiency have an opposite effect on adiposity and energy expenditure which appear to be more directly regulated by PPARγ activity. Although both heterozygous PPARγ deficiency and PPARγ agonist finally improve insulin resistance via decreased TG content in muscle/liver and prevention of adipocyte hypertrophy, there are some important differences between them. First, although both reduced TG content in muscle/liver, heterozygous PPARγ deficiency did so via activation of fatty acid combustion and energy dissipation, whereas TZD did so via potent stimulation of adipogenesis, thereby increasing fatty acid flux from muscle/liver into WAT. Second, both prevented HF diet-induced adipocyte hypertrophy, and TZD markedly increased the number of newly differentiated small adipocytes, whereas heterozygous PPARγ deficiency appeared not to change the total number of adipocytes. Taken together, all of these differences are consistent with the notion that activation of PPARγ plays a role in energy storage and adiposity, and reduction of PPARγ causes energy dissipation and prevention of adiposity. In conclusion, although by different mechanisms, both heterozygous PPARγ deficiency and PPARγ agonist improve insulin resistance via decreased TG content in muscle/liver and prevention of adipocyte hypertrophy (Fig. 7). We thank S. Uchida, K. Kirii, S. Sakata, and T. Nagano for excellent technical assistance.