Deubiquitinating enzymes (DUBs) remove ubiquitin (Ub) from Ub-conjugated substrates to regulate the functional outcome of ubiquitylation. Here we report the discovery of a new family of DUBs, which we have named MINDY (motif interacting with Ub-containing novel DUB family). Found in all eukaryotes, MINDY-family DUBs are highly selective at cleaving K48-linked polyUb, a signal that targets proteins for degradation. We identify the catalytic activity to be encoded within a previously unannotated domain, the crystal structure of which reveals a distinct protein fold with no homology to any of the known DUBs. The crystal structure of MINDY-1 (also known as FAM63A) in complex with propargylated Ub reveals conformational changes that realign the active site for catalysis. MINDY-1 prefers cleaving long polyUb chains and works by trimming chains from the distal end. Collectively, our results reveal a new family of DUBs that may have specialized roles in regulating proteostasis.

The ploidy cycle, integral to sexual reproduction, requires not only meiosis to halve the number of chromosomes, but also mechanisms that ensure zygotes are formed by exactly two partners. During sexual reproduction of the fungal model organism Schizosaccharomyces pombe, haploid P- and M-cells normally fuse to form a diploid zygote that immediately enters meiosis. Here, we reveal that fast post-fusion reconstitution of a bi-partite transcription factor actively blocks re-fertilization. We first identify mutants that undergo transient cell fusion involving cytosol exchange but not karyogamy, and show this drives distinct cell fates in the two gametes: The P-partner undergoes lethal, haploid meiosis while the M-cell persists in mating. Consistently, we find that the zygotic transcription that drives meiosis is initiated rapidly only from the P-parental genome, even in wild type cells. This asymmetric gene expression depends on a bi-partite complex formed post-fusion between the nuclear P-cell-specific homeobox protein Pi and a cytosolic M-specific peptide Mi, which is captured by Pi in the P-nucleus. Zygotic transcription is thus poised to initiate in the P-nucleus as fast as Mi reaches it. The asymmetric nuclear accumulation is inherent to the transcription factor design, and is reconstituted by a pair of synthetic interactors, one localized to the nucleus of one gamete and the other in the cytosol of its partner. Strikingly, imposing a delay in zygotic transcription, by postponing Mi expression or deleting its transcriptional target in the P-genome, leads to zygotes fusing with additional gametes, thus forming polyploids and eventually aneuploid progeny. We further show that the signaling cascade to block re-fertilization shares components with, but bifurcates from, meiotic induction. Thus, cytoplasmic connection upon gamete fusion leads to rapid reconstitution of a bi-partite transcription factor in one partner to block re-fertilization and induce meiosis, thus ensuring genome maintenance during sexual reproduction.

Schizosaccharomyces pombe is a widely used model organism that resembles higher eukaryotes in many aspects of cell physiology. Its popularity as an experimental system partially stems from the ease of genetic manipulations, where the innate homology-targeted repair is exploited to precisely edit the genome. While vectors to incorporate exogenous sequences into the chromosomes are available, most are poorly characterized. Here we show that commonly used fission yeast vectors, which upon integration produce repetitive genomic regions, yield unstable genomic loci. We overcome this problem by designing a new series of Stable Integration Vectors (SIV) that target four different prototrophy genes. SIV produce non-repetitive, stable genomic loci and integrate predominantly as single copy. Additionally, we develop a set of complementary auxotrophic alleles that preclude false-positive integration events. We expand the vector series to include antibiotic resistance markers, promoters, fluorescent tags and terminators, and build a highly modular toolbox to introduce heterologous sequences. Finally, as proof of concept, we generate a large set of ready-to-use, fluorescent probes to mark organelles and cellular processes with a wide range of applications in fission yeast research.

Abstract To ensure genome stability, sexually reproducing organisms require that mating brings together exactly two haploid gametes and that meiosis occurs only in diploid zygotes. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe , fertilization triggers the Mei3-Pat1-Mei2 signaling cascade, which represses subsequent mating and initiates meiosis. Here, we establish a degron system to specifically degrade proteins post-fusion and demonstrate that mating blocks not only safeguard zygote ploidy but also prevent lysis caused by aberrant fusion attempts. Using long-term imaging and flow-cytometry approaches, we identify previously unrecognized and independent roles for Mei3 and Mei2 in zygotes. We show that Mei3 promotes premeiotic S-phase independently of Mei2 and that cell cycle progression is both necessary and sufficient to reduce zygotic mating behaviors. Mei2 imposes the meiotic program and promotes the meiotic cycle, but also blocks mating behaviors independently of Mei3 and cell cycle progression. Thus, we find that fungi preserve zygote ploidy and survival by at least two mechanisms where the zygotic fate imposed by Mei2 and the cell cycle re-entry triggered by Mei3 synergize to prevent zygotic mating.