Abstract The interplay between 3D chromatin architecture and gene silencing is incompletely understood. Here, we report a novel point mutation in the non-canonical SMC protein SMCHD1 that enhances its silencing capacity at endogenous developmental targets and at the facioscapulohumeral muscular dystrophy associated macro-array, D4Z4. Heightened SMCHD1 silencing perturbs developmental Hox gene activation, causing a homeotic transformation in mice. Paradoxically, the mutant SMCHD1 appears to enhance insulation against another epigenetic regulator complex, PRC2, while depleting long range chromatin interactions akin to what is observed in the absence of SMCHD1. These data suggest that SMCHD1’s role in long range chromatin interactions is not directly linked to gene silencing or insulating the chromatin, refining the model for how the different levels of SMCHD1-mediated chromatin regulation interact to bring about gene silencing in normal development and disease.

Abstract The BAF complex modulates chromatin accessibility. Specific BAF configurations have functional consequences, and subunit switches are essential for cell differentiation. ARID1B and its paralog ARID1A encode for mutually exclusive BAF subunits. De novo ARID1B haploinsufficient mutations cause a neurodevelopmental disorder spectrum, including Coffin-Siris syndrome, which is characterized by neurological and craniofacial features. Here, we reprogrammed ARID1B +/- Coffin-Siris patient-derived skin fibroblasts into iPSCs and modeled cranial neural crest cell (CNCC) formation. We discovered that ARID1B is active only during the first stage of this process, coinciding with neuroectoderm specification, where it is part of a lineage-specific BAF configuration (ARID1B-BAF), which includes SMARCA4 and nine additional subunits. ARID1B-BAF acts as a gatekeeper, ensuring exit from pluripotency and lineage commitment, by attenuating NANOG, SOX2 and thousands of enhancers directly regulated by these two pluripotency factors at the iPSC stage. In iPSCs, these enhancers are maintained active by an ARID1A-containing BAF. At the onset of differentiation, cells transition from ARID1A-BAF to ARID1B-BAF, eliciting attenuation of the NANOG/SOX2 networks, and triggering pluripotency exit. Coffin-Siris patient cells fail to perform the ARID1A/ARID1B switch and maintain ARID1A-BAF at pluripotency enhancers throughout all stages of CNCC formation. This leads to a persistent and aberrant SOX2 and NANOG activity, which impairs CNCC formation. In fact, despite showing the typical neural crest signature (TFAP2A + , SOX9 + ), ARID1B -haploinsufficient CNCCs are also NANOG/OCT4-positive, in stark contrast with the ARID1B -wt CNCCs, which are NANOG/OCT4-negative. These findings suggest a connection between ARID1B mutations, neuroectoderm formation, and a pathogenic mechanism for Coffin-Siris syndrome.

Grainyhead like 2 (GRHL2) is one of three mammalian homologues of the grainyhead (GRH) gene. It suppresses the oncogenic epithelial-mesenchymal transition (EMT), acting as a tumor suppressor. On the other hand, GHRL2 promotes cell proliferation by increasing human telomerase reverse transcriptase (hTERT) activity, serving as a tumor promoter. According to gene expression profiling, breast cancer can be divided into basal-like (basal A and basal B), luminal-like, HER2 enriched, claudin-low and normal-like subtypes. To identify common and subtype-specific genomic binding sites of GRHL2 in breast cancer, GRHL2 ChIP-seq was performed in three luminal-like and three basal A human breast cancer cell lines. Most binding sites of GRHL2 were found in intergenic and intron regions. 13,351 common binding sites were identified in basal A cells, which included 551 binding sites in gene promoter regions. For luminal-like cells, 6,527 common binding sites were identified, of which 208 binding sites were found in gene promoter regions. Basal A and luminal-like breast cancer cells shared 4711 GRHL2 binding sites, of which 171 binding sites were found in gene promoter regions. The identified GRHL2-binding motifs are all identical to a motif reported for human ovarian cancer, indicating conserved GRHL2 DNA-binding among human cancer cells. Notably, no binding sites of GRHL2 were detected in the promoter regions of several established EMT-related genes, including CDH1, ZEB1, ZEB2 and CDH2 genes. Collectively, this study provides a comprehensive overview of interactions of GRHL2 with DNA and lays the foundation for further understanding of common and subtype-specific signaling pathways regulated by GRHL2 in breast cancer.

DNA methylation is a key epigenetic modification in human development and disease, yet there is limited understanding of its highly coordinated regulation. Here, we identified 818 genes that influence DNA methylation patterns in blood using large-scale population genomics data. By employing genetic instruments as causal anchors, we identified directed associations between gene expression and distant DNA methylation levels, whilst ensuring specificity of the associations by correcting for linkage disequilibrium and pleiotropy among neighboring genes. We found that DNA methylation patterns are commonly shaped by transcription factors that consistently increase or decrease DNA methylation levels. However, we also observed genes encoding proteins without DNA binding activity with widespread effects on DNA methylation (e.g. NFKBIE , CDCA7(L) and NLRC5 ) and we suggest plausible mechanisms underlying these findings. Many of the reported genes were unknown to influence DNA methylation, resulting in a comprehensive resource providing insights in the principles underlying epigenetic regulation.

Most disease associated genetic risk factors are non-coding, making it challenging to design experiments to understand their functional consequences. Identification of expression quantitative trait loci (eQTLs) has been a powerful approach to infer downstream effects of disease variants but the large majority remains unexplained.. The analysis of DNA methylation, a key component of the epigenome, offers highly complementary data on the regulatory potential of genomic regions. However, a large-scale, combined analysis of methylome and transcriptome data to infer downstream effects of disease variants is lacking. Here, we show that disease variants have wide-spread effects on DNA methylation in trans that likely reflect the downstream effects on binding sites of cis-regulated transcription factors. Using data on 3,841 Dutch samples, we detected 272,037 independent cis-meQTLs (FDR < 0.05) and identified 1,907 trait-associated SNPs that affect methylation levels of 10,141 different CpG sites in trans (FDR < 0.05), an eight-fold increase in the number of downstream effects that was known from trans-eQTL studies. Trans-meQTL CpG sites are enriched for active regulatory regions, being correlated with gene expression and overlap with Hi-C determined interchromosomal contacts. We detected many trans-meQTL SNPs that affect expression levels of nearby transcription factors (including NFKB1, CTCF and NKX2-3), while the corresponding trans-meQTL CpG sites frequently coincide with its respective binding site. Trans-meQTL mapping therefore provides a strategy for identifying and better understanding downstream functional effects of many disease-associated variants.

Genetic risk factors often localize in non-coding regions of the genome with unknown effects on disease etiology. Expression quantitative trait loci (eQTLs) help to explain the regulatory mechanisms underlying the association of genetic risk factors with disease. More mechanistic insights can be derived from knowledge of the context, such as cell type or the activity of signaling pathways, influencing the nature and strength of eQTLs. Here, we generated peripheral blood RNA-seq data from 2,116 unrelated Dutch individuals and systematically identified these context-dependent eQTLs using a hypothesis-free strategy that does not require prior knowledge on the identity of the modifiers. Out of the 23,060 significant cis-regulated genes (false discovery rate ≤ 0.05), 2,743 genes (12%) show context-dependent eQTL effects. The majority of those were influenced by cell type composition, revealing eQTLs that are particularly strong in cell types such as CD4+ T-cells, erythrocytes, and even lowly abundant eosinophils. A set of 145 cis-eQTLs were influenced by the activity of the type I interferon signaling pathway and we identified several cis-eQTLs that are modulated by specific transcription factors that bind to the eQTL SNPs. This demonstrates that large-scale eQTL studies in unchallenged individuals can complement perturbation experiments to gain better insight in regulatory networks and their stimuli.

Abstract Background Loss of epigenetic control is a hallmark of aging. Among the most prominent roles of epigenetic mechanisms is the inactivation of one of two copies of the X chromosome in females through DNA methylation. Hence, age-related disruption of X-chromosome inactivation (XCI) may contribute to the ageing process in women. Methods We analyzed 9,777 CpGs on the X chromosome in whole blood samples from 2343 females and 1688 males. We replicated findings in duplicate using one whole blood and one purified monocyte data set (in total, 991/924 females/males). We used double generalized linear models (DGLM) to detect age-related differentially methylated CpGs (aDMCs), whose mean methylation level differs with age, and age-related variable methylated CpGs (aVMCs), whose methylation level becomes more variable with age. Results In females, aDMCs were relatively uncommon (n=33) and preferentially occurred in regions known to escape XCI. In contrast, many CpGs (n=987) were found to display an increased variance with age (aVMCs). Of note, the replication rate of aVMCs was also high in purified monocytes (95%), indicating that their occurrence may be independent of cell composition. aVMCs accumulated in CpG islands and regions subject to XCI. Although few aVMCs were associated with X-linked genes in all females studied, an exploratory analysis suggested that such associations may be more common in old females. In males, aDMCs (n=316) were primarily driven by cell composition, while aVMCs replicated well (94%) but were infrequent (n=37). Conclusions Age-related DNA methylation differences at the inactive X chromosome are dominated by the accumulation of variability.

Abstract Integrating multi-omics data into predictive models has the potential to enhance accuracy, which is essential for precision medicine. In this study, we developed interpretable predictive models for multi-omics data by employing neural networks informed by prior biological knowledge, referred to as visible networks. These neural networks offer insights into the decision-making process and can unveil novel perspectives on the underlying biological mechanisms associated with traits and complex diseases. We tested the performance, interpretability and generalizability for inferring smoking status, subject age and LDL levels using genome-wide RNA expression and CpG methylation data from the blood of the BIOS consortium (four population cohorts, N total = 2940). In a cohort-wise cross-validation setting, the consistency of the diagnostic performance and interpretation was assessed. Performance was consistently high for predicting smoking status with an overall mean AUC of 0.95 (95% CI: 0.90–1.00) and interpretation revealed the involvement of well-replicated genes such as AHRR , GPR15 and LRRN3 . LDL-level predictions were only generalized in a single cohort with an R 2 of 0.07 (95% CI: 0.05–0.08). Age was inferred with a mean error of 5.16 (95% CI: 3.97–6.35) years with the genes COL11A2, AFAP1 , OTUD7A , PTPRN2 , ADARB2 and CD34 consistently predictive. For both regression tasks, we found that using multi-omics networks improved performance, stability and generalizability compared to interpretable single omic networks. We believe that visible neural networks have great potential for multi-omics analysis; they combine multi-omic data elegantly, are interpretable, and generalize well to data from different cohorts.

DNA methylation is a key epigenetic modification essential for normal development. How particular factors control DNA methylation patterns and activity of a given locus is incompletely understood. The zinc finger protein Zbtb24 has been implicated in transcriptional activation/repression and the DNA methylation maintenance pathway. Here, using whole genome bisulfite sequencing in mouse embryonic stem cells, we report that besides a general trend towards DNA hypomethylation, many genomic sites gain methylation in the absence of Zbtb24 and they include promoters of actively transcribed genes. DNA hypomethylation is not generally associated with gene expression changes, suggesting that additional epigenetic safeguards are in place that ensure silencing of the affected loci. Remarkably, we identify a set of genes that is particularly susceptible to Zbtb24 occupancy. At these sites, Zbtb24 binding is not only required for gene activity but also required for maintaining the unmethylated state of the promoter.