Abstract The Netrin-1 receptor UNC5B is an axon guidance regulator that is also expressed in endothelial cells (ECs), where it finely controls developmental and tumor angiogenesis. In the absence of Netrin-1, UNC5B induces apoptosis that is blocked upon Netrin-1 binding. Here, we identify an UNC5B splicing isoform (called UNC5B-Δ8) expressed exclusively by ECs and generated through exon skipping by NOVA2, an alternative splicing factor regulating vascular development. We show that UNC5B-Δ8 is a constitutively pro-apoptotic splicing isoform insensitive to Netrin-1 and required for specific blood vessel development in an apoptosis-dependent manner. Like NOVA2, UNC5B-Δ8 is aberrantly expressed in colon cancer vasculature where its expression correlates with tumor angiogenesis and poor patient outcome. Collectively, our data identify a mechanism controlling UNC5B’s necessary apoptotic function in ECs and suggest that the NOVA2/UNC5B circuit represents a post-transcriptional pathway regulating angiogenesis.

Hydroxylysine glycosylations are collagen-specific post-translational modifications essential for maturation and homeostasis of fibrillar as well as non-fibrillar collagen molecules. Lysyl hydroxylase 3 (LH3) is the only human enzyme capable of performing two chemically-distinct collagen glycosyltransferase reactions using the same catalytic site: inverting beta-1,O-galactosylation of hydroxylysines and retaining alpha-1,2-glycosylation of galactosyl hydroxylysines.Here, we used structure-based mutagenesis to show that both glycosyltransferase activities are strongly dependent on a broad cooperative network of amino acid side chains which includes the first-shell environment of the glycosyltransferase catalytic site and shares features with both retaining and inverting enzymes. We identified critical “hot spots” leading to selective loss of inverting activity without affecting the retaining reaction. Finally, we present molecular structures of LH3 in complex with UDP-sugar analogs which provide the first structural templates for LH3 glycosyltransferase inhibitor development.Collectively, our data provide a comprehensive overview of the complex network of shapes, charges and interactions that enable LH3 glycosyltransferase activities, expanding the molecular framework for the manipulation of glycosyltransferase functions in biomedical and biotechnological applications.

Abstract The gene neurofibromatosis 1 (NF1) is increasingly recognized as a key somatic driver of cancerogenesis, in addition to its well-known role as the germline determinant of the onco-developmental syndrome Neurofibromatosis. NF1 is best characterized as a negative regulator of RAS activation, but several lines of evidence suggest that it may have additional, poorly characterized functions. In breast cancer, NF1 loss is known to be associated with resistance to endocrine and HER2-targeted therapy. Here, using HER2+ breast cancer cell lines engineered to ablate NF1 by CRISPR-Cas9 and in vitro reductionist models, we show that NF1 is a bona fide Microtubule-Associated Protein (MAP) with a novel, RAS-independent role in regulating dynamic instability and intra-lattice repair of microtubules. We show that loss of NF1 results in multiple mitotic defects (enlarged mitotic plate, delayed mitotic exit, supranumerary centrosomes and chromosome misalignment) that generate a low-grade aneuploidy that can also be measured as increased aneuploidy score in breast cancer patients bearing pathogenic NF1 mutations. Loss of NF1 leads to increased sensitivity to the approved Antibody-Drug Conjugate T-DM1 and in particular to its payload of the maytansin family, thus representing the first payload-specific predictive biomarker. These findings highlight a novel function for an established tumor suppressor and support the assessment of NF1 status to guide tailored treatment decision in breast cancer

During biosynthesis, collagen lysine residues undergo extensive post-translational modifications essential for the stability and functions of collagen supramolecular assemblies. In the endoplasmic reticulum, two distinct metal ion dependent enzyme families (i.e., multifunctional lysyl hydroxylases-glucosyltransferases LH/PLODs and galactosyltransferases GLT25D/COLGALT) alternatively operate on collagen lysine side chains ultimately generating the highly conserved α-(1,2)-glucosyl-β-(1,O)-galactosyl-5-hydroxylysine pattern. Malfunctions in the collagen lysine post-translational modification machinery is linked to multiple developmental pathologies as well as extracellular matrix alterations causing enhanced cellular proliferation and invasiveness of several solid tumors, prompting for an in-depth characterization of LH/PLOD and GLT25D/COLGALT enzyme families. Here, we present an integrative molecular study of GLT25D1/COLGALT, highlighting an elongated head-to-head homodimeric assembly characterized by an N-terminal segment of each monomer wrapping around its dimerization partner. Each monomer encompasses two Rossman fold-type domains (GT1 and GT2) separated by an extended linker. Both domains were found capable of binding Mn2+ cofactors and UDP-α-galactose donor substrates, resulting in four candidate catalytic sites per dimer. Site-directed mutagenesis and biochemical studies identify the C-terminal GT2 domain as the functional GLT25D1/COLGALT1 catalytic site, highlighting an unprecedented Glu-Asp-Asp motif critical for metal ion binding, and suggesting structural roles for the N-terminal GT1 essential for correct quaternary structure assembly. Conversely, dimerization was not a requirement for GLT25D1/COLGALT1 enzymatic activity in vitro, suggesting that the elongated enzyme homodimer assembly, resembling that of LH/PLOD binding partners, could represent a functional hallmark for correct recognition and successful processing of collagen lysine residues.

Abstract SARS-CoV-2 proximal origin is still unclear, limiting the possibility of foreseeing other spillover events with pandemic potential. Here we propose an evolutionary model based on the thorough dissection of SARS-CoV-2 and RaTG13 – the closest bat relative – spike dynamics, kinetics and binding to ACE2. Our results indicate that both spikes share nearly identical, high affinities for Rhinolophus affinis bat and human ACE2, pointing out to negligible species barriers directly related to receptor binding. Also, SARS-CoV-2 spike shows a higher degree of dynamics and kinetics optimization that favors ACE2 engagement. Therefore, we devise an affinity-independent evolutionary process that likely took place in R. affinis bats and limits the eventual involvement of other animal species in initiating the pandemic to the role of vector.

Abstract There is great interest in the identification of biomarkers to guide development of antibody-drug conjugates (ADC). Most research has focused on target expression, but key predictors of payload efficacy have not been indeitifed. NF1 is a tumor suppressor classically considered as an inhibitor of RAS signaling, and often mutated in metastatic HER2+ breast cancer (BC). We screened multiple approved drugs for differential sensitivityin CRISPR-engineeredf NF1 KO cells. HER2-targeted agents (small molecules or antibodies) were found to be less effective upon NF1 loss; surprisingly, we identified increased sensitivity to the approved ADC T-DM1, but not to Trastuzumab Deruxtecan (T-Dxd). We then elucidated the underlying molecular cause employing in vivo, in vitro and in vitro reductionist systems. To measure in vivo MT dynamics, we transiently transfected the MT end-binding protein EB3- GFP and reconstructed MT trajectories by live-cell imaging. Upon DM1 treatment, KO cells showed a highly significant reduction in MT speed, demonstrating a direct role for NF1 on MT dynamics in cells. In tubulin polymerization assays, recombinant NF1 greatly accelerated polymerization and completely rescued DM1-induced inhibition. NF1 induced significant MT bundling, a defining feature of many MT-associated proteins, which generates signal indistinguishable from true MT polymerization in turbidity assays. To follow the dynamics of individual microtubules, we applied Total Internal Reflection (TIRF) microscopy on glass-immobilized MTs. As expected, polymerization in the presence of NF1 led to a dose-dependent significant increase in MT dynamics (fraction of elongating MTs, elongation speed, catastrophe rate). Expectedly, DM1 led to significant reduction in the fraction of elongating MTs and speed, but these defects were completely or partially rescued by NF1. Importantly, DM1 did not only lead to MT shortening (as proposed by the current model), but also to clear and frequent MT fracturing, indicating that the drug is not only engaging MT ends but also intra-tubular binding sites. This is consistent with recent models of MT formation which incorporate the frequent presence of areas of discontinuity or damage induced by mechanical stress, exposing intratubular DM1 binding sites. Interestingly, adding NF1 to DM1-treated MTs generated areas of de novo intra-tubular tubulin insertion, coincident with damaged sites, suggesting an entirely novel role for NF1 in MT repair. In conclusion, we provide evidence for a model in which maytansinoids bind not only to soluble tubulin dimers and MT ends, but also to intratubular damaged sites. Thus, the number of binding sites in cells would be proportional to MT damage, suggesting a mechanism for differential efficacy across tumor types and a potential avenue for combinatorial drug development. These results prompt the use of NF1 as a biomarker to select patients for ADC treatment. Funding: FIEO fellowship 2023, AIRC (n25791), Italian MoH-Ricerca Corrente di Rete (ACCORD) 2022, Next Generation EU – PNRR M6C2 – PNRR-MAD-2022-12376934 Citation Format: Eleonora Messuti, Bruno Achutti Duso, Alessia Castiglioni, Giulia Tini, Emanuele Bonetti, Giuseppe Ciossani, Silvia Monzani, Daria Khuntsariya, Marcus Braun, Zdenek Lansky, Luigi Scietti, Luca Mazzarella. NF1 loss is syntetic lethal with Trastuzumab emtansine [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Expanding and Translating Cancer Synthetic Vulnerabilities; 2024 Jun 10-13; Montreal, Quebec, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(6 Suppl):Abstract nr A013.