Allosteric interactions are typically considered to proceed through a series of discrete changes in bonding interactions that alter the protein conformation. Here we show that allostery can be mediated exclusively by transmitted changes in protein motions. We have characterized the negatively cooperative binding of cAMP to the dimeric catabolite activator protein (CAP) at discrete conformational states. Binding of the first cAMP to one subunit of a CAP dimer has no effect on the conformation of the other subunit. The dynamics of the system, however, are modulated in a distinct way by the sequential ligand binding process, with the first cAMP partially enhancing and the second cAMP completely quenching protein motions. As a result, the second cAMP binding incurs a pronounced conformational entropic penalty that is entirely responsible for the observed cooperativity. The results provide strong support for the existence of purely dynamics-driven allostery.

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) between a donor (D) and an acceptor (A) at the single-molecule level currently provides qualitative information about distance, and quantitative information about kinetics of distance changes. Here, we used the sorting ability of confocal microscopy equipped with alternating-laser excitation (ALEX) to measure accurate FRET efficiencies and distances from single molecules, using corrections that account for cross-talk terms that contaminate the FRET-induced signal, and for differences in the detection efficiency and quantum yield of the probes. ALEX yields accurate FRET independent of instrumental factors, such as excitation intensity or detector alignment. Using DNA fragments, we showed that ALEX-based distances agree well with predictions from a cylindrical model of DNA; ALEX-based distances fit better to theory than distances obtained at the ensemble level. Distance measurements within transcription complexes agreed well with ensemble-FRET measurements, and with structural models based on ensemble-FRET and x-ray crystallography. ALEX can benefit structural analysis of biomolecules, especially when such molecules are inaccessible to conventional structural methods due to heterogeneity or transient nature.

Using fluorescence resonance energy transfer to monitor distances within single molecules of abortively initiating transcription initiation complexes, we show that initial transcription proceeds through a “scrunching” mechanism, in which RNA polymerase (RNAP) remains fixed on promoter DNA and pulls downstream DNA into itself and past its active center. We show further that putative alternative mechanisms for RNAP active-center translocation in initial transcription, involving “transient excursions” of RNAP relative to DNA or “inchworming” of RNAP relative to DNA, do not occur. The results support a model in which a stressed intermediate, with DNA-unwinding stress and DNA-compaction stress, is formed during initial transcription, and in which accumulated stress is used to drive breakage of interactions between RNAP and promoter DNA and between RNAP and initiation factors during promoter escape.

The bacterial transcription initiation complex preorganizes promoter DNA for nucleotide binding and RNA synthesis.

A sequence element located immediately upstream of the TATA element, and having the consensus sequence 5′-G/C-G/C-G/A-C-G-C-C-3′, affects the ability of transcription factor IIB to enter transcription complexes and support transcription initiation. The sequence element is recognized directly by the transcription factor IIB. Recognition involves α-helices 4′ and 5′ of IIB, which comprise a helix–turn–helix DNA-binding motif. These observations establish that transcription initiation involves a fourth core promoter element, the IIB recognition element (BRE), in addition to the TATA element, the initiator element, and the downstream promoter element, and involves a second sequence-specific general transcription factor, IIB, in addition to transcription factor IID.

Using single-molecule DNA nanomanipulation, we show that abortive initiation involves DNA “scrunching”—in which RNA polymerase (RNAP) remains stationary and unwinds and pulls downstream DNA into itself—and that scrunching requires RNA synthesis and depends on RNA length. We show further that promoter escape involves scrunching, and that scrunching occurs in most or all instances of promoter escape. Our results support the existence of an obligatory stressed intermediate, with approximately one turn of additional DNA unwinding, in escape and are consistent with the proposal that stress in this intermediate provides the driving force to break RNAP-promoter and RNAP-initiation-factor interactions in escape.

Using single-molecule fluorescence resonance energy transfer, we have defined bacterial RNA polymerase (RNAP) clamp conformation at each step in transcription initiation and elongation. We find that the clamp predominantly is open in free RNAP and early intermediates in transcription initiation but closes upon formation of a catalytically competent transcription initiation complex and remains closed during initial transcription and transcription elongation. We show that four RNAP inhibitors interfere with clamp opening. We propose that clamp opening allows DNA to be loaded into and unwound in the RNAP active-center cleft, that DNA loading and unwinding trigger clamp closure, and that clamp closure accounts for the high stability of initiation complexes and the high stability and processivity of elongation complexes.

Abstract Rho and NusG mediate factor-dependent transcription termination in Escherichia coli . Here, we report preparation of complexes functional in factor-dependent termination from RNA polymerase (RNAP), Rho, NusG, and synthetic nucleic-acid scaffolds, and we report cryo-EM structures of complexes. The structures show that functional factor-dependent pre-termination complexes contain a closed-ring Rho hexamer, have RNA threaded through the central channel of Rho, have 60 nt of RNA interacting sequence-specifically with the exterior of Rho and 6 nt of RNA interacting sequence-specifically with the central channel of Rho, have Rho oriented relative to RNAP such that ATP-hydrolysis-dependent translocation by Rho exerts mechanical force on RNAP, and have NusG bridging Rho and RNAP. The results explain five decades of research on Rho and provide a foundation for understanding Rho function. One sentence summary Cryo-EM reveals the structure of the functional Rho pre-termination complex

Abstract Transcription initiation starts with unwinding of promoter DNA by RNA polymerase (RNAP) to form a catalytically competent RNAP-promoter complex (RP O ). Despite extensive study, the mechanism of promoter unwinding has remained unclear, in part due to the transient nature of intermediates on path to RPo. Here, using single-molecule unwinding-induced fluorescence enhancement to monitor promoter unwinding, and single-molecule fluorescence resonance energy transfer to monitor RNAP clamp conformation, we analyze RPo formation at a consensus bacterial core promoter. We find that the RNAP clamp is closed during promoter binding, remains closed during promoter unwinding, and then closes further, locking the unwound DNA in the RNAP active-centre cleft. Our work defines a new, “bind-unwind-load-and-lock,” model for the series of conformational changes occurring during promoter unwinding at a consensus bacterial promoter and provides the tools needed to examine the process in other organisms and at other promoters. Significance statement Transcription initiation, the first step and most important step in gene expression for all organisms, involves unwinding of promoter DNA by RNA polymerase (RNAP) to form an open complex (RPo); this step also underpins transcriptional regulation and serves as an antibiotic target. Despite decades of research, the mechanism of promoter DNA unwinding has remained unresolved. Here, we solve this puzzle by using single-molecule fluorescence to directly monitor conformational changes in the promoter DNA and RNAP in real time during RPo formation. We show that RPo forms via a “ bind-unwind-load-and-lock ” mechanism, where the promoter unwinds outside the RNAP cleft, the unwound template DNA loads into the cleft, and RNAP “locks” the template DNA in place by closing the RNAP clamp module.