Abstract Nitrogen (N) is an essential macronutrient for crop growth and yield, but excessive application of N fertilizer has caused serious environmental pollution and greatly increased the cost of agricultural production. One of the effective and economical solutions to this dilemma is to improve the N use efficiency (NUE) of crops. Although some components involved in regulating NUE have been identified, the underlying molecular mechanism remains largely elusive in rice. Here we report that the OsNLP3 (NIN-like protein 3) is an important regulator in NUE and grain yield under nitrate-sufficient conditions. Both NUE and grain yield were significantly improved by enhanced OsNLP3 expression in the field, but reduced in osnlp3 mutants. The expression of OsNLP3 responds to both nitrate and ammonium, while OsNLP3 nuclear retention is only induced by nitrate, not by ammonium. OsNLP3 regulates the expression of a set of genes involved in N transport and assimilation by directly binding to the nitrate-responsive cis -element in the promoters of these genes. Our study demonstrates that OsNLP3 is significant for the regulation of NUE and grain yield, particularly in nitrate-rich conditions, thus providing a candidate for improving NUE and grain yield in rice.

ABSTRACT Sensile plants constantly experience environmental stresses in nature. They must have evolved effective mechanisms to balance growth with stress response. Here we report the MADS-box transcription factor AGL16 acting as a negative regulator in stress response. Loss-of- AGL16 confers resistance to salt stress in seed germination, root elongation, and soil-grown plants, while elevated AGL16 expression confers the opposite phenotypes compared with wild type. However, the sensitivity to ABA in seed germination is inversely correlated with AGL16 expression level. Transcriptomic comparison revealed that the improved salt resistance of agl16 mutant was largely attributed to enhanced expression of stress responsive transcriptional factors and genes involved in ABA signaling and ion homeostasis. We further demonstrated that AGL16 directly binds to the CArG motifs in the promoter of HKT1;1 , HsfA6a, and MYB102 and represses their expression. Genetic analyses with double mutants also support that HsfA6a and MYB102 are target genes of AGL16. Taken together, our results show that AGL16 acts as negative regulator transcriptionally suppressing key components in stress response and may play a critical role in balancing stress response with growth.

Abstract Salt stress is a major constraint of plant growth and yield. Nitrogen (N) fertilizers are known to alleviate salt stress. However, the underlying molecular mechanisms remain unclear. Here we show that OsNLP4-OsMADS27 module controls nitrate-dependent salt tolerance in rice. The expression of OsMADS27 is specifically induced by nitrate. The OsMADS27 knockout mutants are more sensitive to salt stress than the wild type, whereas the OsMADS27 overexpression lines are more tolerant. Transcriptomic analyses revealed that OsMADS27 controls the expression of a number of known stress-responsive genes as well as those involved in ion homeostasis and antioxidation. We demonstrated that OsMADS27 directly binds to the promoter of OsHKT1.1 and OsSPL7 to regulate their expression. Notably, OsMADS27 -mediated salt tolerance is nitrate-dependent and positively correlated with nitrate concentration. We further showed that OsNLP4, a nitrate-responsive key regulator in N metabolism and N use efficiency, positively regulates the expression of OsMADS27 by directly binding to the nitrate-responsive cis -element in its promoter, thereby transmitting the nitrate signal to OsMADS27 and conferring its nitrate dependence. Our results reveal the role of nitrate-responsive OsNLP4-OsMADS27 module and its downstream target genes in salt tolerance, filling the gap in the molecular mechanism of nitrate-dependent salt tolerance of rice. Moreover, OsMADS27 overexpression increased grain yield under salt stress in presence of sufficient nitrate, indicating that OsMADS27 is a promising candidate for the improvement of salt tolerance in rice.

Abstract Rice panicles, a major component of yield, are regulated by phytohormones and nutrients. How mineral nutrients promote panicle architecture remains largely unknown. Here, we report that NIN-LIKE PROTEIN3 and 4 (OsNLP3/4) are crucial positive regulators of rice panicle architecture in response to nitrogen (N). Loss-of- function mutants of either OsNLP3 or OsNLP4 produced smaller panicles with reduced primary and secondary branches and fewer grains compared with wild type, whereas their overexpression plants showed the opposite phenotypes. Notably, the OsNLP3/4-regulated panicle architecture was positively correlated with N availability. OsNLP3/4 directly bind to the promoter of OsRFL and activate its expression to promote inflorescence meristem development. Furthermore, OsRFL activates OsMOC1 expression by binding to its promoter. Our findings reveal the novel N- responsive OsNLP3/4-OsRFL-OsMOC1 module that integrates N availability to regulate panicle architecture, shedding light on how nutrient signals regulate panicle architecture and providing candidate targets for the improvement of crop yield.

Abstract Nutrients must be balanced for optimal plant growth. However, the potential significance of balanced nitrogen-iron (N-Fe) for improving crop yield and nitrogen use efficiency (NUE) has never been addressed. Here, we show that balanced N-Fe substantially increases tiller number and boosts yield and NUE in rice and wheat. NIN-like protein 4 plays a pivotal role in maintaining the N-Fe balance by coordinately regulating the expression of multiple genes in N and Fe metabolism and signaling. Moreover, we show that foliar spraying of balanced N-Fe at the tillering stage can effectively increase rice tillers, yield and NUE in the field, which can be reproduced with wheat. Our findings provide guidelines for innovative fertilization to reduce N fertilizer input and promote yield, thus benefitting environment-friendly and sustainable agriculture worldwide.

Abstract Vascular plants have evolved sophisticated mechanisms of long-distance signaling to cope with environmental stress. Reactive oxygen species (ROS) act as systemic signals in plant stress responses. However, it is not known whether ROS serve as root-to-shoot signals in the drought response. Here, we show that ferric reductase defective3 ( frd3 ) mutants exhibit enhanced drought resistance concomitant with increased NCED3 transcript levels and ABA contents in leaves. The frd3 mutants also have an elevated hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) level in roots and leaves compared with the wild type. Grafting experiments demonstrate that drought resistance can be conferred by the frd3 rootstock, suggesting that long-distance signals derived in frd3 roots trigger ABA level increases in leaves and thereby enhance drought resistance and that H 2 O 2 is a strong candidate for long-distance signals. Furthermore, comparative transcriptome and proteomics analyses revealed that many genes and proteins involved in the abiotic stress response, ROS homeostasis, and signaling pathways were affected in the frd3 mutant, supporting the drought resistance phenotype. Taken together, our findings suggest that frd3 root-derived long-range signals activate ABA synthesis in leaves and enhance drought resistance, indicating possible root-to-shoot H 2 O 2 signaling in the plant drought response.

ABSTRACT Weed is one of the major biotic stresses that causes severe loss of crop yield. Herbicide is one of the most cost-effective ways to control weeds. Thus, the development of herbicide-resistant crops is critical for the application of herbicides. To isolate new glufosinate ammonium resistance loci, we screened a rice ethyl methyl sulfonate-mutagenized library and obtained the g lufosinate a mmonium- r esistant mutant gar1-1 . GAR1 encodes auxin response factor 18 ( OsARF18 ). A G-to-A substitution in the coding region of OsARF18 results in loss of function of OsARF18 and thereby enhances glufosinate ammonium resistance of gar1-1 , which was confirmed by three additional CRISPR/Cas9-edited gar1 alleles. GLUTAMINE SYNTHETASE 1;1 ( OsGS1;1 ) and GLUTAMINE SYNTHETASE 1;2 ( OsGS1;2 ) were upregulated in gar1-1 upon glufosinate ammonium treatment, directly contributing to increased GS activity that enhances glufosinate ammonium herbicide resistance. We further show that OsARF18 suppresses OsGS1;1 and OsGS1;2 expression. Comparative transcriptomic analyses reveal a huge shift in the gene expression profile involved in stress tolerance and growth. A large number of detoxification-related genes are enriched in gar1-1 , which may also contribute to enhanced herbicide resistance. Moreover, stress tolerance-related genes are upregulated and growth-related genes are downregulated in gar1-1 , consistent with the improved tolerance to salt and osmotic stress of gar1 mutants. Taken together, our study demonstrates that OsARF18 is a negative regulator of glufosinate ammonium resistance as well as salt and osmotic stress tolerance, suggesting a role in balancing the stress response and growth.

Nitrogen (N) is indispensable for crop growth and yield, but excessive agricultural application of nitrogenous fertilizers has generated severe environmental problems. A desirable and economical solution to cope with these issues is to improve crop nitrogen use efficiency (NUE). Plant NUE has been a focal point of intensive research worldwide, yet much more has to be learned about its genetic determinants and regulation. Here, we show that rice NIN-LIKE PROTEIN 1 (OsNLP1) plays a fundamental role in N utilization. OsNLP1 protein localizes in nucleus and its transcript level is rapidly induced by N starvation. Overexpression of OsNLP1 improves plant growth, grain yield and NUE under different N conditions while knockout of OsNLP1 impairs grain yield and NUE under N limiting conditions. OsNLP1 regulates nitrate and ammonium utilization by cooperatively orchestrating multiple N uptake and assimilation genes. Chromatin immunoprecipitation and yeast-one-hybrid assays show that OsNLP1 can directly bind to the promoter of these genes to activate their expression. Therefore, our results demonstrate that OsNLP1 is a key regulator of N utilization and represents a potential target for improving NUE and yield in rice.

ABSTRACT Paraquat is one of the most widely used non-selective herbicides and has elicited the emergence of paraquat resistant weeds. However, the molecular mechanisms of paraquat resistance are not completely understood. Here we report an Arabidopsis gain-of-function mutant pqt15-D with significantly enhanced resistance to paraquat and the corresponding PQT15 encoding the MATE transporter DTX6. A point mutation at +932 bp in DTX6 causing the G311E amino acid residue change brings about the enhanced paraquat resistance of pqt15-D . Overexpression of DTX6/PQT15 in the wild type also confers strong paraquat resistance, whereas the DTX6/PQT15 knockout mutants exhibits hypersensitive phenotype to paraquat. Moreover, heterologous expression of DTX6 and DTX6-D in E. coli significantly enhances bacterial resistance to paraquat. DTX6/PQT15 mainly localizes in the plasma membrane as shown by DTX6-GFP and functions as a paraquat efflux transporter as demonstrated by paraquat efflux assays with isolated protoplasts and bacterial cells. Taken together, our results demonstrate that DTX6/PQT15 is an efflux transporter and confers paraquat resistance by exporting paraquat out of cytosol, therefore unraveling a molecular mechanism of paraquat resistance in higher plants and providing a promising candidate of generating paraquat resistance crops.

Plants frequently suffer from environmental stresses in nature and have evolved sophisticated and efficient mechanisms to cope with the stresses. To balance between growth and stress response, plants are equipped with efficient means to switch off the activated stress responses when stresses diminish. We previously revealed such an off-switch mechanism conferred by Arabidopsis PQT3, knockout of which significantly enhances resistance to abiotic stresses. To explore whether the rice homolog OsPQT3 is functionally conserved, we generated three knockout mutants with CRISPR-Cas9 technology. The OsPQT3 knockout mutants (ospqt3) display enhanced resistance to oxidative and salt stress with elevated expression of OsGPX1, OsAPX1, and OsSOD1. More importantly, the ospqt3 mutants show significantly enhanced agronomic performance with higher yield compared with the wild type under salt stress in greenhouse as well as in field conditions. We further showed that OsPQT3 was rapidly down regulated in response to oxidative and other abiotic stresses as AtPQT3. Taken together, these results support our previous findings that AtPQT3 acts as an off-switch in stress response, which is well conserved in rice. Therefore, PQT3 locus provides a promising candidate for crop improvement with enhanced stress resistance by gene editing technology.