Changes to mitochondrial architecture are associated with various adaptive and pathogenic processes. However, quantification of changes to mitochondrial structures are limited by the yet unmet challenge of defining the borders of each individual mitochondrion within an image. Here, we describe a novel method for segmenting Brown Adipose Tissue (BAT) images. We describe a granular approach to quantifying subcellular structures, particularly mitochondria in close proximity to lipid droplets, peri-droplet mitochondria. In addition, we lay out a novel machine-learning-based mitochondrial segmentation method that eliminates the bias of manual mitochondrial segmentation and improves object recognition compared to conventional thresholding analyses. By applying these methods, we discovered a significant difference between cytosolic and peridroplet BAT mitochondrial H2O2 production, and validated the machine learning algorithm in BAT via norepinephrine-induced mitochondrial fragmentation and comparing manual analyses to the automated analysis. This approach provides a higher-throughput analysis protocol to quantify ratiometric probes in subpopulations of mitochondria in adipocytes.

A sharp increase in mitochondrial Ca2+ marks the activation of the brown adipose tissue (BAT) thermogenesis, yet the mechanisms preventing Ca2+ deleterious effects are poorly understood. Here, we show that adrenergic stimulation of BAT activates a PKA-dependent mitochondrial Ca2+ extrusion via the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger, NCLX. Adrenergic stimulation of NCLX-ablated brown adipocytes (BA) induces a profound mitochondrial Ca2+ overload and impaired uncoupled respiration. Core body temperature, PET imaging and VO2 measurements confirm a BAT specific thermogenic defect in NCLX-null mice. We show that mitochondrial Ca2+ overload induced by adrenergic stimulation of NCLX-null BAT, triggers the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), leading to remarkable mitochondrial swelling, Cytochrome c release and cell death in BAT. However, treatment with mPTP inhibitors rescue mitochondrial respiratory function and thermogenesis in NCLX-null BA, in vitro and in vivo. Our findings identify a novel pathway enabling non-lethal mitochondrial Ca2+ elevation during adrenergic stimulation of uncoupled respiration. Deletion of NCLX transforms the adrenergic pathway responsible for the stimulation of thermogenesis into a death pathway.

Changes in mitochondrial size and shape have been implicated in several physiological processes, but their role in mitochondrial Ca2+ uptake regulation and overall cellular Ca2+ homeostasis is largely unknown. Here we show that modulating mitochondrial dynamics towards increased fusion through expression of a dominant negative form of the fission protein DRP1 (DRP1-DN) markedly increased both mitochondrial Ca2+ retention capacity and Ca2+ uptake rates in permeabilized C2C12 cells. Similar results were seen using the pharmacological fusion-promoting M1 molecule. Conversely, promoting a fission phenotype through the knockdown of the fusion protein mitofusin 2 (MFN2) strongly reduced mitochondrial Ca2+ uptake speed and capacity in these cells. These changes were not dependent on modifications in inner membrane potentials or the mitochondrial permeability transition. Implications of mitochondrial morphology modulation on cellular calcium homeostasis were measured in intact cells; mitochondrial fission promoted lower basal cellular calcium levels and lower endoplasmic reticulum (ER) calcium stores, as measured by depletion with thapsigargin. Indeed, mitochondrial fission was associated with ER stress. Additionally, the calcium-replenishing process of store-operated calcium entry (SOCE) was impaired in MFN2 knockdown cells, while DRP1-DN-promoted fusion resulted in faster cytosolic Ca2+ increase rates. Overall, our results show a novel role for mitochondrial morphology in the regulation of mitochondrial Ca2+ uptake, which impacts on cellular Ca2+ homeostasis.