ABSTRACT A small population of self-renewing stem cells initiate tumors and maintain therapeutic resistance in glioblastoma. Given the limited treatment options and dismal prognosis for this disease there is urgent need to identify drivers of stem cells that could be druggable targets. Previous work showed that the endosomal pH regulator NHE9 is upregulated in glioblastoma and correlates with worse survival prognosis. Here, we probed for aberrant signaling pathways in patient-derived glioblastoma cells and found that NHE9 increases cell surface expression and phosphorylation of multiple receptor tyrosine kinases by promoting their escape from lysosomal degradation. Downstream of NHE9-mediated receptor activation, oncogenic signaling pathways converged on the JAK2-STAT3 transduction axis to induce pluripotency genes Oct4 and Nanog and suppress markers of glial differentiation. We used both genetic and chemical approaches to query the role of endosomal pH in glioblastoma phenotypes. Loss-of-function mutations in NHE9 that failed to alkalinize endosomal lumen did not increase self-renewal capacity of gliomaspheres in vitro . However, monensin, a chemical mimetic of Na + /H + exchanger activity, and the H + pump inhibitor bafilomycin bypassed NHE9 to directly alkalinize the endosomal lumen resulting in stabilization of receptor tyrosine kinases and induction of Oct4 and Nanog. Using orthotopic models of primary glioblastoma cells we found that NHE9 increased tumor initiation in vivo . We propose that NHE9 initiates inside-out signaling from the endosomal lumen, distinct from the established effects of cytoplasmic and extracellular pH on tumorigenesis. Endosomal pH may be an attractive therapeutic target that diminishes stemness in glioblastoma, agnostic of specific receptor subtype. Significance A well-known hallmark of cancer is excessive acidification of tumor microenvironment, caused by upregulation of Na + /H + exchanger activity on the cancer cell membrane. However, the role of organellar pH in tumor biology has not been established. This study identifies a mechanistic link between upregulation of the endosomal Na + /H + exchanger NHE9 and stemness properties in glioblastoma, the most malignant and common brain tumor in adults. By increasing pH of the recycling endosome, NHE9 exerts a broad effect on post-translational stability and activation of multiple receptor tyrosine kinases, leading to increased stem cell-like properties of self-renewal and tumor initiation in glioblastoma models. Our findings suggest that targeting NHE9 or endosomal pH could be an effective strategy for receptor agnostic glioblastoma treatment.

Although the mainstay of treatment for hormone responsive breast tumors is targeted endocrine therapy, many patients develop de novo or acquired resistance and are treated with chemotherapeutic drugs. The vast majority (80%) of estrogen receptor positive tumors also express wild type p53 protein that is a major determinant of the DNA damage response. Tumors that are ER+ and p53WT respond poorly to chemotherapy, although the underlying mechanisms are not completely understood. We describe a novel link between store independent Ca2+ entry (SICE) and resistance to DNA damaging drugs, mediated by the secretory pathway Ca2+-ATPase, SPCA2. In luminal ER+/PR+ breast cancer subtypes, SPCA2 levels are high and correlate with poor survival prognosis. Independent of ion pump activity, SPCA2 elevates baseline Ca2+ levels through SICE and drives cell proliferation. Attenuation of SPCA2 or depletion of extracellular Ca2+ increased mitochondrial ROS production, DNA damage and activation of the ATM/ATR-p53 axis leading to G0/G1 phase cell cycle arrest and apoptosis. Consistent with these findings, SPCA2 knockdown confers chemosensitivity to DNA damaging agents including doxorubicin, cisplatin and ionizing radiation. We conclude that elevated SPCA2 expression in ER+ p53WT breast tumors drives pro-survival and chemotherapy resistance by suppressing the DNA damage response. Drugs that target store-independent Ca2+ entry pathways may have therapeutic potential in treating receptor positive breast cancer.

Progression of benign tumors to invasive, metastatic cancer is accompanied by the epithelial to mesenchymal transition (EMT), characterized by loss of the cell-adhesion protein E-cadherin. Although silencing mutations and transcriptional repression of the E-cadherin gene have been widely studied, not much is known about post-translational regulation of E-cadherin in tumors. We show that E-cadherin is tightly co-expressed with the secretory pathway Ca2+-ATPase isoform 2, SPCA2 (ATP2C2), in breast tumors. Loss of SPCA2 impairs surface expression of E-cadherin and elicits mesenchymal gene expression through disruption of cell adhesion in tumorspheres and downstream Hippo-YAP signaling. Conversely, ectopic expression of SPCA2 in triple negative breast cancer (TNBC) elevates baseline Ca2+ and YAP phosphorylation, enhances post-translational expression of E-cadherin, and suppresses mesenchymal gene expression. Thus, loss of SPCA2 phenocopies loss of E-cadherin in the Hippo signaling pathway and EMT-MET transitions, consistent with a functional role for SPCA2 in E-cadherin biogenesis. Furthermore, we show that SPCA2 suppresses invasive phenotypes, including cell migration in vitro and tumor metastasis in vivo. Based on these findings, we propose that SPCA2 functions as a key regulator of EMT and may be a potential therapeutic target for treatment of metastatic cancer. Implications: Post-translational control of E-cadherin and the Hippo pathway by calcium signaling regulates epithelial mesenchymal transition in breast cancer cells.

The need to meet the all-year round green vegetable demands of the ever-growing population, especially in the urban and peri-urban towns of Ondo State, has made dry-season irrigation inevitable. Moreover, dry-season green vegetable farming provides an opportunity for smallholder farmers to further extend their cropping season, increase productivity, and ultimately improve their earnings. Thus, the aim of the present study was to carry out an assessment of irrigation water quality for dry-season green vegetable (Amaranthus crentus L.) farming in Ondo State, Nigeria. Ten (10) water samples covering at least three (3) major towns/cities in each of the three senatorial districts were collected from different green vegetable farms across the state during the dry season. Thereafter, samples of water collected were taken to the laboratory for both physicochemical and microbial analyses. Mean values of physicochemical parameters such as pH (6.12), EC (338.8 µS/cm), turbidity (4.03 NTU), TSS (0.428 mg/L), TDS (169.4 mg/L), and BOD (2.141 mg/L) were within the permissible levels, while COD (154 mg/L) and total hardness (135.24 mg/L) were above the limits. Microbial analysis also showed that total viable coliform counts (TVCC) were higher than the recommended limit, while total viable E. coli counts (TVEC) fell below detectable levels. Therefore, it was concluded that the irrigation water used for dry-season green vegetable farming in Ondo State was relatively of good quality, which serves as an encouragement to both farmers and consumers of the vegetable. However, given the higher levels of total hardness and TVCC, continuous monitoring and assessment of irrigation water quality in the state, especially beyond the areas presently covered, and awareness campaigns against urban surface water pollution to prevent potential faecal contamination of the sources and avert possible ingestion of pathogenic organisms through the consumption of green vegetables are recommended.

Abstract The secretory pathway Ca 2+ -ATPase SPCA2 is a tumor suppressor in triple receptor negative breast cancer (TNBC), a highly aggressive molecular subtype that lacks tailored treatment options. Low expression of SPCA2 in TNBC confers poor survival prognosis in patients. Previous work has established that re-introducing SPCA2 to TNBC cells restores basal Ca 2+ signaling, represses mesenchymal gene expression, mitigates tumor migration in vitro and metastasis in vivo . In this study, we examined the effect of histone deacetylase inhibitors (HDACi) in TNBC cell lines. We show that the pan-HDACi vorinostat and the class I HDACi romidepsin induce dose-dependent upregulation of SPCA2 transcript with concurrent downregulation of mesenchymal markers and tumor cell migration characteristic of epithelial phenotype. Silencing SPCA2 abolished the ability of HDACi to reverse epithelial to mesenchymal transition (EMT). Independent of ATPase activity, SPCA2 elevated resting Ca 2+ levels to activate downstream components of non-canonical Wnt/Ca 2+ signaling. HDACi treatment led to SPCA2-dependent phosphorylation of CAMKII and β-catenin, turning Wnt signaling off. We conclude that SPCA2 mediates the efficacy of HDACi in reversing EMT in TNBC by a novel mode of non-canonical Wnt/Ca 2+ signaling. Our findings provide incentive for screening epigenetic modulators that exploit Ca 2+ signaling pathways to reverse EMT in breast tumors. Simple Summary The triple receptor negative breast cancer subtype, or TNBC, currently has no tailored treatment options. TNBC is highly metastatic, associated with high patient mortality, and disproportionately occurs in Black/African American women where it contributes to racial disparities in health outcomes. Therefore, we focused on new therapeutic approaches to TNBC. We discovered that levels of the Calcium-ATPase SPCA2 are abnormally low in TNBC and that these low levels correlate with poor survival prognosis in patients. Previously, we showed that recombinant SPCA2 prevented TNBC cells from acquiring aggressive ‘mesenchymal’ properties associated with metastasis both in vitro and in vivo . These findings motivated us to search for drugs that turn the SPCA2 gene back on in TNBC cells. In this study, we show that histone deacetylase inhibitors increase SPCA2 levels, activate Ca 2+ signaling and convert cancer cells to a less aggressive ‘epithelial’ state. These findings could lead to new treatment options for TNBC. Graphical Abstract