Vitrification is the state-of-the-art specimen preparation technique for molecular electron microscopy (EM) and therefore negative staining may appear to be an outdated approach. In this paper we illustrate the specific advantages of negative staining, ensuring that this technique will remain an important tool for the study of biological macromolecules. Due to the higher image contrast, much smaller molecules can be visualized by negative staining. Also, while molecules prepared by vitrification usually adopt random orientations in the amorphous ice layer, negative staining tends to induce preferred orientations of the molecules on the carbon support film. Combining negative staining with image classification techniques makes it possible to work with very heterogeneous molecule populations, which are difficult or even impossible to analyze using vitrified specimens.

In cells lacking centrosomes, such as those found in female meiosis, chromosomes must nucleate and stabilize microtubules in order to form a bipolar spindle. Here we report the identification of Dasra A and Dasra B, two new components of the vertebrate chromosomal passenger complex containing Incenp, Survivin, and the kinase Aurora B, and demonstrate that this complex is required for chromatin-induced microtubule stabilization and spindle formation. The failure of microtubule stabilization caused by depletion of the chromosomal passenger complex was rescued by codepletion of the microtubule-depolymerizing kinesin MCAK, whose activity is negatively regulated by Aurora B. By contrast, we present evidence that the Ran-GTP pathway of chromatin-induced microtubule nucleation does not require the chromosomal passenger complex, indicating that the mechanisms of microtubule assembly by these two pathways are distinct. We propose that the chromosomal passenger complex regulates local MCAK activity to permit spindle formation via stabilization of chromatin-associated microtubules.

Abstract The mitotic spindle, a self-constructed microtubule-based machine, segregates chromosomes into two eventual daughter nuclei. In mammalian cells, microtubule bundles called kinetochore-fibers (k-fibers) anchor chromosomes within the spindle. Chromosome segregation thus depends on the mechanical integrity of k-fibers. Here, we investigate the physical and molecular basis of k-fiber bundle cohesion. We sever k-fibers using laser ablation, thereby detaching them from poles and testing the contribution of pole-localized force generation to k-fiber cohesion. We then measure the physical response of the remaining kinetochore-bound segments of the k-fibers. We observe that microtubules within ablated k-fibers often, but not always, splay apart from their minus-ends. Furthermore, we find that minus-end clustering forces induced in response to ablation seem at least partially responsible for k-fiber splaying. We also investigate the role of the putative k-fiber-binding kinesin-12 Kif15. We find that pharmacological inhibition of Kif15 microtubule binding reduces k-fiber mechanical integrity. In contrast, inhibition of its motor activity but not its microtubule binding does not greatly affect splaying. Altogether, the data suggest that forces holding k-fibers together are of similar magnitude to other spindle forces, and that Kif15, acting as a microtubule crosslinker, helps fortify and repair k-fibers. This feature of Kif15 may help support robust k-fiber function and prevent chromosome segregation errors.

Abstract The chromatin modifier SETD2 was recently shown to be a dual-function methyltransferase that “writes” methyl marks on both chromatin and the mitotic spindle, revealing α-tubulin methylation as a new posttranslational modification of microtubules. Here, we report the first cytoskeletal “reader” for this SETD2 methyl mark: the polybromo protein PBRM1. We found PBRM1 directly binds the α-Tub-K40me3 mark on tubulin, and localizes to the mitotic spindle and spindle pole during cell division. PBRM1 can assemble a PBAF complex in the absence of chromatin as revealed by mass spectrometry, and can recruit other PBAF complex components including SMARCA4 and ARID2 to α-tubulin. In addition to PBRM1, other PBAF components were also localized to the mitotic spindle and spindle pole. This PBAF localization was dependent on recruitment to microtubules by PBRM1, and loss of spindle-associated PBRM1/PBAF led to genomic instability as assessed by increased formation of micronuclei. These data reveal a previously unknown function for PBRM1 beyond its role remodeling chromatin, and expand the repertoire of chromatin remodelers involved in writing and reading methyl marks on the cytoskeleton. The results of this study lay the foundation for a new paradigm for the epigenetic machinery as chromatocytoskeletal modifiers, with coordinated nuclear and cytoskeletal functions.

The mechanical properties of the cellular cortex regulate shape changes during cell division, cell migration and tissue morphogenesis. During cell division, contractile force generated by the molecular motor myosin II (MII) at the equatorial cortex drives cleavage furrow ingression. Cleavage furrow ingression in turn increases stresses at the polar cortex, where contractility must be regulated to maintain cell shape during cytokinesis. How polar cortex contractility controls cell shape is poorly understood. We show a balance between MII paralogs allows a fine-tuning of cortex tension at the polar cortex to maintain cell shape during cytokinesis, with MIIA driving cleavage furrow ingression and bleb formation, and MIIB serving as a stabilizing motor and mediating completion of cytokinesis. As the majority of non-muscle contractile systems are cortical, this tuning mechanism will likely be applicable to numerous processes driven by MII contractility.

Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare cancer in which tissue-specific differentiation is paradoxically associated with dismal outcomes. The differentiated ACC subtype CIMP-high is prevalent, incurable, and routinely fatal. CIMP-high ACC possess abnormal DNA methylation and frequent β-catenin activating mutations. Here, we demonstrate that ACC differentiation is maintained by a balance between nuclear, tissue-specific β-catenin-containing complexes and the epigenome. On chromatin, β-catenin binds master adrenal transcription factor SF1 and hijacks the adrenocortical super-enhancer landscape to maintain differentiation. Off chromatin, β-catenin binds histone methyltransferase EZH2, which is redistributed by the CIMP-high DNA methylation signature. SF1/β-catenin and EZH2/β-catenin complexes exist in normal adrenals and are selected for through all phases of ACC evolution. Pharmacologic EZH2 inhibition in CIMP-high ACC favors EZH2/β-catenin assembly and purges SF1/β-catenin from chromatin, erasing differentiation and restraining cancer growth in vitro and in vivo . Our studies illustrate how tissue-specific programs shape oncogene selection, surreptitiously encoding targetable therapeutic vulnerabilities.

Summary Factors governing the faithful replication of chromosomes are essential for cellular and genomic integrity. While a variety of mechanisms to manage breaks and promote repair of DNA are widely recognized, epigenetic landmarks that preserve telomere-to-telomere replication fidelity and prevent genome instability are not well-understood. SETD2 is the histone methyltransferase responsible for trimethylation on histone H3 lysine 36 and is newly recognized as a tumor suppressor that acts to maintain genome stability. Importantly, SETD2 is frequently lost in cancers that exhibit extensive intratumoral heterogeneity. Here, we demonstrate that loss of SETD2 and H3K36me3 promotes chromosome segregation errors and DNA bridging during mitosis, and that these bridges are driven by the formation of dicentric chromosomes. Cytogenetic analyses revealed that these chromosomes were comprised of mirror-imaged isochromosomes and isodicentric chromosomes that contain two active centromeres. These data demonstrate that the SETD2 histone methyltransferase is essential to prevent a palindromic replication intermediate, whose loss precipitates the formation of a mutable chromatin structure known to initiate a cascade of genomic instability in cancer.

ABSTRACT Kinesins are tightly regulated in space and time to control their activation in the absence of cargo-binding. Kinesin-binding protein (KIFBP) was recently discovered to bind the catalytic motor heads of 8 of the 45 known kinesin superfamily members and inhibit binding to microtubules. In humans, mutation of KIFBP gives rise to Goldberg-Shprintzen syndrome (GOSHS), but the kinesin(s) that is misregulated to produce clinical features of the disease is not known. Understanding the structural mechanism by which KIFBP selects its kinesin binding partners will be key to unlocking this knowledge. Using a combination of cryo-electron microscopy and crosslinking mass spectrometry, we determined structures of KIFBP alone and in complex with two mitotic kinesins, revealing regions of KIFBP that participate in complex formation. KIFBP adopts an alpha-helical solenoid structure composed of TPR repeats. We find that KIFBP uses a 2-pronged mechanism to remodel kinesin motors and block microtubule-binding. First, KIFBP engages the microtubule-binding interface and sterically blocks interaction with microtubules. Second, KIFBP induces allosteric conformational changes to the kinesin motor head that displace a key structural element in the kinesin motor head (α-helix 4) required for microtubule binding. We identified two regions of KIFBP necessary for in vitro kinesin-binding as well as cellular regulation during mitosis. Taken together, this work establishes the mechanism of kinesin inhibition by KIFBP and provides the first example of motor domain remodeling as a means to abrogate kinesin activity.

Chromosome alignment at the equator of the mitotic spindle is a highly conserved step during cell division, however, its importance to genomic stability and cellular fitness are not understood. Normal mammalian somatic cells lacking Kif18A function complete cell division without aligning chromosomes. These alignment-deficient cells display normal chromosome copy numbers in vitro and in vivo, suggesting that chromosome alignment is largely dispensable for maintenance of euploidy. However, we find that loss of chromosome alignment leads to interchromosomal compaction defects during anaphase, abnormal organization of chromosomes into a single nucleus at mitotic exit, and the formation of micronuclei in vitro and in vivo. These defects slow cell proliferation and reduce postnatal growth and survival with variable penetrance in mice. Our studies support a model in which the alignment of mitotic chromosomes promotes proper nuclear envelope reassembly and continued proliferation by ensuring that chromosomes segregate as a compact mass during anaphase.