Pathogenic Yersinia resist uptake by eukaryotic cells by a mechanism involving the virulence protein YopH, a protein tyrosine phosphatase. We show that p130Cas and FAK are phosphorylated and recruited to peripheral focal complexes during bacterial uptake in HeLa cells. The inactive form of YopH interacts with the tyrosine phosphorylated forms of FAK and p130Cas and co-localizes with these proteins in focal adhesions. On the other hand, the presence of active YopH results in inhibition of uptake, dephosphorylation of p130Cas and FAK, and disruption of peripheral focal complexes. We suggest that p130Cas and FAK are substrates for YopH and that the dephosphorylation of these proteins impairs the uptake of Yersinia pseudotuberculosis into HeLa cells.

Abstract Summary Since its introduction, RNA-seq technology has been used extensively in studies of pathogenic bacteria to identify and quantify differences in gene expression across multiple samples from bacteria exposed to different conditions. With some exceptions, the current tools for assessing gene expression have been designed around the structures of eukaryotic genes. There are a few stand-alone tools designed for prokaryotes, and they require improvement. A well-defined pipeline for prokaryotes that includes all the necessary tools for quality control, determination of differential gene expression, downstream pathway analysis, and normalization of data collected in extreme biological conditions is still lacking. Here we describe ProkSeq, a user-friendly, fully automated RNA-seq data analysis pipeline designed for prokaryotes. ProkSeq provides a wide variety of options for analysing differential expression, normalizing expression data, and visualizing data and results, and it produces publication-quality figures. Availability and implementation ProkSeq is implemented in Python and is published under the ISC open source license. The tool and a detailed user manual are hosted at Docker: https://hub.docker.com/repository/docker/snandids/prokseq-v2.1 , Anaconda: https://anaconda.org/snandiDS/prokseq ; Github: https://github.com/snandiDS/prokseq .

Abstract Despite being genetically diverse, bacterial pathogens can adapt to similar stressful environments in human host, but how this diversity allows them to achive this is yet not fully understood. Knowledge gained through comparative genomics is insufficient as it lacks the level of gene expression reflecting gene usage. To fill this gap, we investigated the transcriptome of 32 diverse bacterial pathogens under 11 host related stress conditions. We revealed that diverse bacterial pathogens have common responses to similar stresses to a certain extent but mostly employ their unique repertoire with intersections between different stress responses. We also identified universal stress responders which shed light on the nature of antimicrobial targets. In addition, we found that known and unknown putative novel ncRNAs comprised a significant proportion of the responses. All the data is collected in PATHOgenex atlas, providing ample opportunities to discover novel players critical for virulence and maintenance of infection.

Abstract A hallmark in salmonellosis is the ability of the bacteria to proliferate within host cells. Most notably, Salmonella proliferates within professional phagocytes in a vacuolar compartment. During proliferation Salmonella has to build new cell wall, but how this is regulated within the intraphagosomal niche is not known. Here we show that genetically inactivating the periplasmic protease Prc, involved in cleaving peptidoglycan-processing enzymes, results in decreased fitness in macrophage-like RAW264.7 cells and in BALB/c mice, and in a decreased tolerance to redox stress. All these prc mutant phenotypes were conditional depending on pbp3sal , a recently defined paralogue for ftsl coding for the essential penicillin binding protein 3. These phenotypic connections between Prc and PBP3 SAL adds to the phenotypes governed by Prc, and possibly adds PBP3 SAL to the pool of target proteins involved in cell wall homeostasis that are regulated by Prc.

ABSTRACT RpoN, an alternative sigma factor commonly known as sigma 54, is implicated in persistent stages of Yersinia pseudotuberculosis infections in which genes associated with this regulator are upregulated. We here combined phenotypic and genomic assays to provide insight into its role and function in this pathogen. RpoN was found essential for Y. pseudotuberculosis virulence in mice, and in vitro functional assays showed that it controls biofilm formation and motility. Mapping genome-wide associations of Y. pseudotuberculosis RpoN using chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing identified an RpoN-binding motif located at 103 inter- and intragenic sites on both sense and anti-sense strands. Deletion of rpoN had a large impact on gene expression, including down-regulation of genes encoding proteins involved in flagellar assembly, chemotaxis, and quorum sensing. There were also clear indications of cross talk with other sigma factors, together with indirect effects due to altered expression of other regulators. Matching differential gene expression with locations of the binding sites implicated around 130 genes or operons potentially activated or repressed by RpoN. Mutagenesis of selected intergenic binding sites confirmed both positive and negative regulatory effects of RpoN binding. Corresponding mutations of intragenic sense sites had less impact on associated gene expression. Surprisingly, mutating intragenic sites on the anti-sense strand commonly reduced expression of genes encoded by the corresponding sense strand. IMPORTANCE The alternative sigma factor, RpoN (σ 54), which is widely distributed in eubacteria have been implicated to control gene expression of importance for numerous functions including virulence. Proper responses to host environments are crucial for bacteria to establish infection and regulatory mechanisms involved are therefore of high interest for development of future therapeutics. Little is known about the function of RpoN in the intestinal pathogen Y. pseudotuberculosis and we therefore investigated its regulatory role in this pathogen. This regulator was indeed found to be critical for establishment of infection in mice, likely involving its requirement for motility and biofilm formation. The RpoN regulon involved both activating and suppressive effects on gene expression which could be confirmed with mutagenesis of identified binding sites. This is the first of its kind study of RpoN in Y. pseudotuberculosis revealing complex regulation of gene expression involving both productive and silent effects of its binding to DNA providing important information about RpoN regulation in enterobacteria.

Abstract Pathogenic Yersinia spp. depend on the activity of a potent virulence plasmid-encoded ysc / yop type 3 secretion system (T3SS) to colonize hosts and cause disease. It was recently shown that Y. pseudotuberculosis up-regulates the virulence plasmid copy number (PCN) during infection and the resulting elevated gene dose of plasmid-encoded T3SS genes is essential for virulence. When and how this novel regulatory mechanism is deployed and regulates the replication of the virulence plasmid during infection is unknown. In the current study, we applied droplet digital PCR (ddPCR) to investigate the dynamics of Y. pseudotuberculosis virulence PCN variations and growth rates in infected mouse organs. We demonstrated that both PCN and growth varied in different tissues and over time throughout the course of infection, indicating that the bacteria adapted to discrete microenvironments during infection. The PCN was highest in Peyer’s Patches and caecum during the clonal invasive phase of the infection, while the fastest growth rates were found in the draining mesenteric lymph nodes. In deeper, systemic organs, the PCN was lower and more modest growth rates were recorded. Our study indicates that increased gene dosage of the plasmid-encoded T3SS genes is most important early in the infection during invasion of the host. The described ddPCR approach will greatly simplify analyses of PCN, growth dynamics, and bacterial loads in infected tissues, and will be readily applicable to other infection models. Importance Studying pathogenic bacteria proliferating inside infected hosts is challenging using traditional methods, especially the transit and reversible genetic events. The bacteria are effectively diluted by the overwhelming number of host cells present in infected tissues. Using an innovative droplet digital PCR (ddPCR) approach, we have determined the virulence plasmid copy number (PCN) variations and growth rates of Yersinia during the course of infection in a mouse model. Here, we show that both the virulence plasmid copy number and bacterial growth rates display spatiotemporal variations in mice during infection. We demonstrate that the peak-to-trough ratio can be used as a proxy for determining the growth rate of invasive bacterial pathogen during infection, and ddPCR as the method of choice for quantifying DNA in host-pathogen interaction context. This proof-of-concept ddPCR approach can be easily applied for any bacterial pathogens and any infection models, for analysis of PCN, growth dynamics and bacterial loads.

Abstract Previous transcriptional profiling of the enteropathogen Yersinia pseudotuberculosis during persistent stages of colonisation of mouse cecal lymphoid follicles indicated the possible involvement of biofilm in infection maintenance. Not much is known about the mechanisms responsible for biofilm formation by this pathogen, and most current knowledge is based on results of experiments conducted using the related Y. pestis pathogen that forms biofilm in the flea gut. In this study, we performed transcriptional profiling of Y. pseudotuberculosis in biofilms from different biofilm-inducing conditions, bile exposure, amino acid deprivation and in vivo mimicking conditions with and without oxygen. The comparison of differential expression of genes in biofilm versus planktonic bacteria showed a set of 54 core genes that were similarly regulated, independent of inducing condition. This set included many genes that were previously shown to be associated with biofilms, such as hutG, hsmF, hmsT and cpxP that were upreg-ulated and other genes such as hmsP and rfaH that were downregulated. There were also novel biofilm-associated genes, including genes encoding hypothetical proteins. To identify the genes involved in inducing biofilm formation, the gene expression of bacteria during an early initial phase when biofilm starts to form after induction by bile or amino acid depletion was determined. Comparisons of the resulting gene expression profiles with the profiles of non-induced bacteria incubated for the same period of time showed a set of core genes associated with early biofilm formation. This set included genes involved in quorum sensing, pili biogenesis and genes indicative of a potential metabolic shift involving nitrogen utilisation. Genes encoding components of sugar phosphotransferase systems were also up-regulated during biofilm induction. Assays of biofilm formation by bacteria deleted of some of these core genes showed that strains lacking hpr and luxS , which are known to be important for functional sugar phosphotransferase systems and quorum sensing, as well as glnL encoding a sensory histidine kinase were most negatively affected. Most of the deletion mutant strains tested were affected, but the effect was less severe, suggesting high levels of redundancy in the pathways involved in biofilm formation by this pathogen.

Abstract Pathogenic bacteria use a broad range of virulence factors to thrive within their host. Yersinia pseudotuberculosis , a gram-negative enteropathogen in humans, utilises a Type III secretion system to overcome the host’s innate immune response. A global regulator previously shown to be essential for virulence in Y. pseudotuberculosis is RpoN. We show here that a strain lacking RpoN has a severely reduced capacity to secrete Yop effectors. This strain has a substantially reduced expression of genes encoding structural components of the secretion apparatus, the ysc operons, while expression of genes encoding effectors and translocators is less affected. We show that RpoN regulates a complex network, where one part is suggested to contribute to inducing Type III secretion via the enhancer-binding protein GlrR/RpoN regulon. By analogy, during inducement of Type III secretion, RpoN has a positive effect on expression of the sigma factor RpoE, which also is known to act downstream of GlrR. Interestingly, we found putative RpoE binding sites upstream of the ysc operons, and also a partial rescue of Yop secretion in the rpoN mutant strain by overexpression of RpoE. Our findings suggest that the RpoN-mediated effect on expression of type III genes involves a sigma factor hierarchy, where RpoN via RpoE contributes to inducing Type III secretion.

Abstract Mast cells (MCs) localize to mucosal tissues and contribute to innate immune defenses against infection. How MCs sense, differentiate between, and respond to bacterial pathogens remains a topic of ongoing debate. Using the prototype enteropathogen Salmonella Typhimurium ( S .Tm) and other closely related enterobacteria, we here demonstrate that MCs can regulate their cytokine secretion response to distinguish between extracellular and invasive bacterial infection. Tissue-invasive S .Tm and MCs colocalize in the Salmonella -infected mouse gut. Toll-like Receptor 4 (TLR4) sensing of extracellular S .Tm, or pure LPS, causes a slow and modest induction of MC cytokine transcripts and proteins, including IL-6, IL-13, and TNF. By contrast, type-III-secretion-system-1 (TTSS-1)-dependent S .Tm invasion of both mouse and human MCs triggers rapid and potent inflammatory gene expression and >100-fold elevated cytokine secretion. The S .Tm TTSS-1 effectors SopB, SopE, and SopE2 here elicit a second activation signal, including Akt phosphorylation downstream of effector translocation, which combines with TLR activation to promote the full-blown MC response. Supernatants from S .Tm-infected MCs boost macrophage survival and maturation from bone-marrow progenitors. Taken together, this study shows that MCs can differentiate between extracellular and host-cell invasive enterobacteria via a two-step activation mechanism and tune their inflammatory output accordingly.