The covalent modification of nucleosomal histones has emerged as a major determinant of chromatin structure and gene activity. To understand the interplay between various histone modifications, including acetylation and methylation, we performed a genome-wide chromatin structure analysis in a higher eukaryote. We found a binary pattern of histone modifications among euchromatic genes, with active genes being hyperacetylated for H3 and H4 and hypermethylated at Lys 4 and Lys 79 of H3, and inactive genes being hypomethylated and deacetylated at the same residues. Furthermore, the degree of modification correlates with the level of transcription, and modifications are largely restricted to transcribed regions, suggesting that their regulation is tightly linked to polymerase activity.

CD8+ T cells recognizing tumor-specific antigens are detected in cancer patients but are dysfunctional. Here we developed a tamoxifen-inducible liver cancer mouse model with a defined oncogenic driver antigen (SV40 large T-antigen) to follow the activation and differentiation of naive tumor-specific CD8+ T (TST) cells after tumor initiation. Early during the pre-malignant phase of tumorigenesis, TST cells became dysfunctional, exhibiting phenotypic, functional, and transcriptional features similar to dysfunctional T cells isolated from late-stage human tumors. Thus, T cell dysfunction seen in advanced human cancers may already be established early during tumorigenesis. Although the TST cell dysfunctional state was initially therapeutically reversible, it ultimately evolved into a fixed state. Persistent antigen exposure rather than factors associated with the tumor microenvironment drove dysfunction. Moreover, the TST cell differentiation and dysfunction program exhibited features distinct from T cell exhaustion in chronic infections. Strategies to overcome this antigen-driven, cell-intrinsic dysfunction may be required to improve cancer immunotherapy.

The Myc/Max/Mad transcription factor network is critically involved in cell behavior; however, there is relatively little information on its genomic binding sites. We have employed the DamID method to carry out global genomic mapping of the Drosophila Myc, Max, and Mad/Mnt proteins. Each protein was tethered to Escherichia coli DNA adenine-methyltransferase (Dam) permitting methylation proximal to in vivo binding sites in Kc cells. Microarray analyses of methylated DNA fragments reveals binding to multiple loci on all major Drosophila chromosomes. This approach also reveals dynamic interactions among network members as we find that increased levels of dMax influence the extent of dMyc, but not dMnt, binding. Computer analysis using the REDUCE algorithm demonstrates that binding regions correlate with the presence of E-boxes, CG repeats, and other sequence motifs. The surprisingly large number of directly bound loci (∼15% of coding regions) suggests that the network interacts widely with the genome. Furthermore, we employ microarray expression analysis to demonstrate that hundreds of DamID-binding loci correspond to genes whose expression is directly regulated by dMyc in larvae. These results suggest that a fundamental aspect of Max network function involves widespread binding and regulation of gene expression.

Glia are the most abundant cell type in the mammalian brain. They regulate neuronal development and function, CNS immune surveillance, and stem cell biology, yet we know surprisingly little about glia in any organism. Here we identify over 40 new Drosophila glial genes. We use glial cells missing (gcm) mutants and misexpression to verify they are Gcm regulated in vivo. Many genes show unique spatiotemporal responsiveness to Gcm in the CNS, and thus glial subtype diversification requires spatially or temporally restricted Gcm cofactors. These genes provide insights into glial biology: we show unc-5 (a repulsive netrin receptor) orients glial migrations and the draper gene mediates glial engulfment of apoptotic neurons and larval locomotion. Many identified Drosophila glial genes have homologs expressed in mammalian glia, revealing conserved molecular features of glial cells. 80% of these Drosophila glial genes have mammalian homologs; these are now excellent candidates for regulating human glial development, function, or disease.

We report germline missense mutations in ETV6 segregating with the dominant transmission of thrombocytopenia and hematologic malignancy in three unrelated kindreds, defining a new hereditary syndrome featuring thrombocytopenia with susceptibility to diverse hematologic neoplasms. Two variants, p.Arg369Gln and p.Arg399Cys, reside in the highly conserved ETS DNA-binding domain. The third variant, p.Pro214Leu, lies within the internal linker domain, which regulates DNA binding. These three amino acid sites correspond to hotspots for recurrent somatic mutation in malignancies. Functional studies show that the mutations abrogate DNA binding, alter subcellular localization, decrease transcriptional repression in a dominant-negative fashion and impair hematopoiesis. These familial genetic studies identify a central role for ETV6 in hematopoiesis and malignant transformation. The identification of germline predisposition to cytopenias and cancer informs the diagnosis and medical management of at-risk individuals.

Cells are exposed to frequent mechanical and/or chemical stressors that can compromise the integrity of the plasma membrane and underlying cortical cytoskeleton. The molecular mechanisms driving the immediate repair response that is launched to restore the cell cortex and circumvent cell death are largely unknown. Using drug-inhibition studies and microarray analyses in the Drosophila model, we find that initiation of cell wound repair is dependent on translation, whereas transcription is required for subsequent steps in the process. We identified 253 genes whose expression is up-regulated (80) or down-regulated (173) in response to laser wounding. A subset of these genes were validated using RNAi knockdowns and found to exhibit aberrant actomyosin ring assembly and/or actin remodeling defects. Strikingly, we find that disruption of the canonical insulin signaling pathway leads to abnormal wound repair, and that it controls actin dynamics through the actin regulators Girdin and Chickadee (profilin). Our results provide new insight for understanding how cell wound repair proceeds in healthy individuals and those with diseases involving wound healing deficiencies.

Single cell RNA-seq has emerged as a powerful tool for resolving cellular states associated with normal and maligned developmental processes. Here, we used scRNA-seq to examine the cell cycle states of expanding human neural stem cells (hNSCs). From this data, we created a cell cycle classifier, which, in addition to traditional cell cycle phases, also identifies a putative quiescent-like state in neuroepithelial-derived cell types during mammalian neurogenesis and in gliomas. This state, Neural G0, is enriched for expression of quiescent NSC genes and other neurodevelopmental markers found in non-dividing neural progenitors. For gliomas, Neural G0 cell populations and gene expression is significantly associated with less aggressive tumors and extended patient survival. Genetic screens to identify modulators of Neural G0 revealed that knockout of genes associated with the Hippo/Yap and p53 pathways diminished Neural G0 in vitro , resulting in faster G1 transit, down regulation of quiescence-associated markers, and loss of Neural G0 gene expression. Thus, Neural G0 represents a dynamic quiescent-like state found in neuro-epithelial derived cells and gliomas.

Interferon (IFN) inhibits HIV replication by inducing an array of antiviral effectors. Here we describe a novel CRISPR knockout screening approach to identify the ensemble of these HIV restriction factors. We assembled a CRISPR sgRNA library specific for Interferon Stimulated Genes (ISGs) into a modified lentiviral vector that allows for packaging of sgRNA-encoding genomes in trans into budding HIV-1 particles. We observed that knockout of Zinc Antiviral Protein (ZAP) improved the performance of the screen due to ZAP-mediated inhibition of the vector. We identify a small panel of IFN-induced HIV restriction factors, including MxB, IFITM1, Tetherin/BST2 and TRIM5 which together explain the inhibitory effects of IFN on the HIV-1 LAI strain in THP-1 cells. Further, we identify novel HIV dependency factors, including SEC62 and TLR2. The ability of IFN-induced restriction factors to inhibit an HIV strain to replicate in human cells suggests that these human restriction factors are incompletely antagonized.

Abstract Many of the regulatory features governing erythrocyte specification, maturation, and associated disorders remain enigmatic. To identify new regulators of erythropoiesis, we performed a functional genomic screen for genes affecting expression of the erythroid marker CD235a/GYPA. Among validating hits were genes coding for the N 6 -methyladenosine (m 6 A) mRNA methyltransferase (MTase) complex, including, METTL14 , METTL3 , and WTAP . We found that m 6 A MTase activity promotes erythroid gene expression programs and lineage specification through selective translation of >200 m 6 A marked mRNAs, including those coding for SETD methyltransferase, ribosome, and polyA RNA binding proteins. Remarkably, loss of m 6 A marks resulted in dramatic loss of H3K4me3 across key erythroid-specific KLF1 transcriptional targets (e.g., Heme biosynthesis genes). Further, each m 6 A MTase subunit and a subset of their mRNAs targets, including BRD7 , CXXC1 , PABPC1 , PABPC4 , STK40 , and TADA2B , were required for erythroid specification. Thus, m 6 A mRNA marks promote the translation of a network of genes required for human erythropoiesis.