ABSTRACT Purpose Albinism is a clinically and genetically heterogeneous condition. Despite analysis of the nineteen known genes, ∼30% patients remain unsolved. We aimed to identify new genes involved in albinism. Methods We sequenced a panel of genes with known or predicted involvement in melanogenesis in 230 unsolved albinism patients. Results We identified variants in the Dopachrome tautomerase ( DCT ) gene in two patients. One was compound heterozygous for a 14 bp deletion in exon 9 and c.118T>A p.(Cys40Ser). The second was homozygous for c.183C>G p.(Cys61Trp). Both patients had mild hair and skin hypopigmentation, and classical ocular features. CRISPR/Cas9 was used in C57BL/6J mice to create mutations identical to the missense mutations carried by the patients, along with one loss-of-function indel mutation. When bred to homozygosity the three mutations revealed hypopigmentation of the coat, milder for Cys40Ser compared to Cys61Trp or the frameshift mutation. Histological analysis identified significant hypopigmentation of the retinal pigmented epithelium (RPE) indicating that defective RPE melanogenesis could be associated with eye and vision defects. DCT loss of function in zebrafish embryos elicited hypopigmentation both in melanocytes and RPE cells. Conclusions DCT is the gene for a new type of oculocutaneous albinism that we propose to name OCA8.

Abstract As signalling organelles, primary cilia regulate their membrane G protein-coupled receptor (GPCR) content by ectocytosis, a process requiring localised actin dynamics at their tip to alter membrane shape.(1, 2) Mammalian photoreceptor outer segments comprise an expanse of folded membranes (discs) at the tip of highly-specialised connecting cilia (CC), in which photosensitive GPCRs like rhodopsin are concentrated. In an extraordinary feat of biology, outer segment discs are shed and remade daily.(3) Defects in this process, due to genetic mutations, cause retinitis pigmentosa (RP), an untreatable, blinding disease. The mechanism by which photoreceptor cilia generate outer segments is therefore fundamental for vision yet poorly understood. Here, we show the membrane deformation required for outer segment disc genesis is driven by dynamic changes in the actin cytoskeleton in a process akin to ectocytosis. Further, we show RPGR , a leading causal RP gene, regulates activity of actin binding proteins crucial to this process. Disc genesis is compromised in Rpgr mouse models, slowing the actin dynamics required for timely disc formation, leading to aborted membrane shedding as ectosome-like vesicles, photoreceptor death and visual loss. Manipulation of actin dynamics partially rescues the phenotype, suggesting this pathway could be targeted therapeutically. These findings help define how actin-mediated dynamics control outer segment turnover.

Abstract We have recently identified DCT encoding dopachrome tautomerase (DCT) as the 8 th gene for oculocutaneous albinism (OCA). Patients with loss of function of DCT suffer from eye hypopigmentation and retinal dystrophy. Here we investigate the eye phenotype in Dct -/- mice. We show that their retinal pigmented epithelium (RPE) is severely hypopigmented from early stages contrasting with the darker melanocytic tissues. Multimodal imaging reveals specific RPE cellular defects. Melanosomes are fewer with correct subcellular localization but disrupted melanisation. RPE cell size is globally increased and heterogeneous. P-cadherin labeling of Dct -/- newborn RPE reveals a defect in adherens junctions similar to what has been described in tyrosinase-deficient Tyr c/c embryos. The first intermediate of melanin biosynthesis, dihydroxyphenylalanine (L-Dopa), which is thought to control retinogenesis, is detected in substantial yet significantly reduced amounts in Dct -/- postnatal mouse eyecups. L-Dopa synthesis in the RPE alone remains to be evaluated during the critical period of retinogenesis. The Dct -/- mouse should prove useful in understanding the molecular regulation of retinal development and aging of the hypopigmented eye. This may guide therapeutic strategies to prevent vision deficits in patients with albinism.

Inherited retinal diseases (IRDs) are a leading cause of blindness worldwide. One of the greatest barriers to developing treatments for IRDs is the heterogeneity of these disorders, with causative mutations identified in over 280 genes. It is therefore a priority to find therapies applicable to a broad range of genetic causes. To do so requires a greater understanding of the common or overlapping molecular pathways that lead to photoreceptor death in IRDs and the molecular processes through which they converge. Here, we characterise the contribution of different cell death mechanisms to photoreceptor degeneration and loss throughout disease progression in humanised mouse models of IRDs. Using single-cell transcriptomics, we identify common transcriptional signatures in degenerating photoreceptors. Further, we show that in genetically and functionally distinct IRD models, common early defects in autophagy and mitochondrial damage exist, triggering photoreceptor cell death by necroptosis in later disease stages. These results suggest that, regardless of the underlying genetic cause, these pathways likely contribute to cell death in IRDs. These insights provide potential therapeutic targets for novel, gene-agnostic treatments for IRDs applicable to the majority of patients.

Abstract Centrosomes are orbited by centriolar satellites, dynamic multiprotein assemblies nucleated by PCM1. To study the requirement for centriolar satellites, we generated mice lacking PCM1. Pcm1 −/− mice display partially penetrant perinatal lethality with survivors exhibiting hydrocephalus, oligospermia and cerebellar hypoplasia, as well as variable expressivity of other ciliopathy features including cystic kidneys. Pcm1 −/− multiciliated ependymal cells and PCM1 −/− retinal pigmented epithelial 1 (RPE1) cells showed reduced ciliogenesis. PCM1 −/− RPE1 cells displayed reduced docking of the mother centriole to the ciliary vesicle and removal of CP110 and CEP97 from the distal mother centriole, indicating compromized early ciliogenesis. We show these molecular cascades are maintained in vivo , and we suggest that the cellular threshold to trigger ciliogenesis varies between cell types. We propose that PCM1 and centriolar satellites facilitate efficient trafficking of proteins to and from centrioles, inducing the departure of CP110 and CEP97 to initiate ciliogenesis.

PURPOSE We previously found a dominant mutation, Rwhs , causing white spots on the retina accompanied by retinal folds. Here we identify the mutant gene to be Tmem98. In humans, mutations in the orthologous gene cause nanophthalmos. We modelled these mutations in mice and characterised the mutant eye phenotypes of these and Rwhs .METHODS The Rwhs mutation was identified to be a missense mutation in Tmem98 by genetic mapping and sequencing. The human TMEM98 nanophthalmos missense mutations were made in the mouse gene by CRISPR-Cas9. Eyes were examined by indirect ophthalmoscopy and the retinas imaged using a retinal camera. Electroretinography was used to study retinal function. Histology, immunohistochemistry and electron microscopy techniques were used to study adult eyes.RESULTS An I135T mutation of Tmem98 causes the dominant Rwhs phenotype and is perinatally lethal when homozygous. Two dominant missense mutations of TMEM98 , A193P and H196P are associated with human nanophthalmos. In the mouse these mutations cause recessive retinal defects similar to the Rwhs phenotype, either alone or in combination with each other, but do not cause nanophthalmos. The retinal folds did not affect retinal function as assessed by electroretinography. Within the folds there was accumulation of disorganised outer segment material as demonstrated by immunohistochemistry and electron microscopy, and macrophages had infiltrated into these regions.CONCLUSIONS Mutations in the mouse orthologue of the human nanophthalmos gene TMEM98 do not result in small eyes. Rather, there is localised disruption of the laminar structure of the photoreceptors.

Abstract Brittle Cornea Syndrome (BCS) is a rare recessive condition characterised by extreme thinning of the cornea and sclera. BCS results from loss-of-function mutations in the poorly understood genes ZNF469 or PRDM5 . In order to determine the function of ZNF469 and to elucidate pathogenic mechanisms, we used genome editing to recapitulate a human ZNF469 BCS mutation in the orthologous mouse gene, Zfp469 . Ophthalmic phenotyping showed that homozygous Zfp469 mutation causes significant central and peripheral corneal thinning arising from reduced stromal thickness. Expression of key components of the corneal stroma in primary keratocytes from Zfp469 BCS/BCS mice is affected, including decreased Col1a1 and Col1a2 expression. This alters the type I:type V collagen ratio and results in collagen fibrils with smaller diameter and increased fibril density in homozygous mutant corneas, correlating with decreased biomechanical strength in the cornea. Cell-derived matrices generated by primary keratocytes show reduced deposition of type I collagen offering an in vitro model for stromal dysfunction. Work remains to determine whether modulating ZNF469 activity will have therapeutic benefit in BCS or in conditions such as keratoconus where the cornea thins progressively. Summary statement A mouse model of Brittle Cornea Syndrome was created to elucidate molecular mechanisms underlying pathology of this rare connective tissue disorder in which extremely thin corneas rupture, causing irreversible blindness.

The precise control of eye size is essential for normal vision. TMEM98 is a highly conserved and widely expressed gene which appears to be involved in eye size regulation. Mutations in human TMEM98 are found in patients with nanophthalmos (very small eyes) and variants near the gene are associated in population studies with myopia and increased eye size. As complete loss of function mutations in mouse Tmem98 result in perinatal lethality, we produced mice deficient for Tmem98 in the retinal pigment epithelium (RPE), where Tmem98 is highly expressed. These mice have greatly enlarged eyes that are very fragile with very thin retinas. To gain insight into the mechanism of action we used a proximity labelling approach to discover interacting proteins and identified MYRF as an interacting partner. Mutations of MYRF are also associated with nanophthalmos. The protein is an endoplasmic reticulum-tethered transcription factor which undergoes autoproteolytic cleavage to liberate the N-terminal part which then translocates to the nucleus where it acts as a transcription factor. We find that TMEM98 inhibits the self-cleavage of MYRF, in a novel regulatory mechanism. In RPE lacking TMEM98, MYRF is ectopically activated and abnormally localised to the nuclei.