A hallmark of RNA silencing is a class of approximately 22-nucleotide RNAs that are processed from double-stranded RNA precursors by Dicer. Accurate processing by Dicer is crucial for the functionality of microRNAs (miRNAs). The current model posits that Dicer selects cleavage sites by measuring a set distance from the 3′ overhang of the double-stranded RNA terminus. Here we report that human Dicer anchors not only the 3′ end but also the 5′ end, with the cleavage site determined mainly by the distance (∼22 nucleotides) from the 5′ end (5′ counting rule). This cleavage requires a 5′-terminal phosphate group. Further, we identify a novel basic motif (5′ pocket) in human Dicer that recognizes the 5′-phosphorylated end. The 5′ counting rule and the 5′ anchoring residues are conserved in Drosophila Dicer-1, but not in Giardia Dicer. Mutations in the 5′ pocket reduce processing efficiency and alter cleavage sites in vitro. Consistently, miRNA biogenesis is perturbed in vivo when Dicer-null embryonic stem cells are replenished with the 5′-pocket mutant. Thus, 5′-end recognition by Dicer is important for precise and effective biogenesis of miRNAs. Insights from this study should also afford practical benefits to the design of small hairpin RNAs. The microRNAs (miRNAs) prominently involved in gene silencing in plants and animals are typically about 22 nucleotides long. They are produced by sequential cleavage of a longer precursor by two ribonucleases, one of which is Dicer. It was thought that Dicer uses a 'ruler' mechanism, measuring the length from the 3′ end of the double-stranded RNA to make the cleavage that releases the functional 22-nucleotide RNA. Here, V. Narry Kim and colleagues show that Dicer contains a pocket to bind the precursor's phosphorylated 5′ end, and that cleavage is in fact measured by counting the distance from this end. Mutation of the 5′ pocket in Dicer affects miRNA processing in vivo, indicating the importance of this counting mechanism.

ABSTRACT A vital first step of RAF activation involves binding to active RAS, resulting in the recruitment of RAF to the plasma membrane. To understand the molecular details of RAS-RAF interaction, we solved crystal structures of wild-type and oncogenic mutants of KRAS complexed with the RAS-binding domain (RBD) and the membrane-interacting cysteine-rich domain (CRD) from the N-terminal regulatory region of RAF1. Our structures revealed that RBD and CRD interact with each other to form one structural entity in which both RBD and CRD interact extensively with KRAS. Mutation at the KRAS-CRD interface resulted in a significant reduction in RAF1 activation despite only a modest decrease in binding affinity. Combining our structures and published data, we provide a model of RAS-RAF complexation at the membrane, and molecular insights into RAS-RAF interaction during the process of RAS-mediated RAF activation.

ABSTRACT SHOC2 acts as a strong synthetic lethal interactor with MEK inhibitors in multiple KRAS cancer cell lines. SHOC2 forms a heterotrimeric complex with MRAS and PP1C that is essential for regulating RAF and MAPK-pathway activation by dephosphorylating a specific phosphoserine on RAF kinases. Here we present the high-resolution crystal structure of SHOC2-MRAS-PP1C (SMP) complex and apo-SHOC2. Our structures reveal that SHOC2, MRAS and PP1C form a stable ternary complex where all three proteins synergistically interact with each other. Our results show that dephosphorylation of RAF substrates by PP1C is enhanced upon interacting with SHOC2 and MRAS. The SMP complex only forms when MRAS is in an active state and is dependent on SHOC2 functioning as a scaffolding protein in the complex by bringing PP1C and MRAS together. Our results provide structural insights into the role of the SMP complex in RAF activation, how mutations found in Noonan syndrome enhance the complex formation and reveal new avenues for therapeutic interventions.

Abstract Ras proteins are GTPases that regulate a wide range of cellular processes. The activity of Ras is dependent on its nucleotide-binding status, which is modulated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs). Previously, we demonstrated that mutation of lysine 104 to glutamine (K104Q) attenuates the transforming capacity of oncogenic K-Ras by interrupting GEF induced nucleotide exchange. To assess the effect of this mutation in vivo , we used CRISPR/Cas9 to generate mouse models carrying the K104Q point mutation in wild-type and conditional K-Ras LSL-G12D alleles. Consistent with our previous findings from in vitro studies, the oncogenic activity of K-Ras G12D was significantly attenuated by mutation at K104 in vivo . These data demonstrate that lysine at position 104 is critical for the full oncogenic activity of mutant K-Ras and suggest that modification at K104, for example acetylation, may also regulate its activity. In addition, animals homozygous for K104Q were viable, fertile, and arose at Mendelian frequency, indicating that K104Q is not a complete loss of function mutation. Using biochemical and structural analysis, we found that the G12D and K104Q mutations cooperate to suppress GEF-mediated nucleotide exchange, explaining the preferential effect of K104Q on oncogenic K-Ras. Finally, we discovered an allosteric regulatory network consisting of K104 and residues including G75 on switch II (SWII) that is the key for regulating the stability of the α helix on SWII. In this allosteric network, K104-G75 interaction might be primary for keeping stabilization of SWII. Given the high frequency of KRAS mutations in human cancers, modulation of this network may provide a unique therapeutic approach.

Abstract RIT1 belongs to the family of Ras guanosine triphosphatases (GTPases) that regulate many aspects of signal transduction and are drivers of cancer and congenital disorders. RIT1 gain-of-function mutations are found in lung cancer, leukemia, and in the germline of Noonan syndrome individuals with an increased prevalence of cardiac hypertrophy and other congenital heart defects. Pathogenic RIT1 proteins evade proteasomal degradation and promote MEK/ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) hyperactivation, yet the mechanism remains poorly understood. Here we show that RAF kinases are putative mutant RIT1 effectors necessary for MAPK activation and characterize RIT1 association with plasma membrane lipids and interaction with RAF kinases. We identify critical residues present in the RIT1 hypervariable region that facilitate interaction with negatively charged membrane lipids and show that these are necessary for association with RAF kinases. Although mutant RIT1 binds to RAF kinases directly, it fails to activate RAF-MAPK signaling in the absence of classical Ras proteins. Consistent with aberrant RAF/MEK/ERK activation as a driver of disease, we show that MEK inhibition alleviates cardiac hypertrophy in a mouse model of RIT1-mutant Noonan syndrome. These data shed light on pathogenic RIT1 function and identify avenues for therapeutic intervention. One Sentence Summary Electrostatic plasma membrane association facilitates RIT1-mediated Ras-dependent RAF kinase activation to promote pathogenic MAPK signaling.

Abstract Approved inhibitors of KRASG12C prevent oncogenic activation by sequestering the inactive, GDP-bound (OFF) form rather than directly binding and inhibiting the active, GTP-bound (ON) form. This approach provides no direct target coverage of the active protein. Expectedly, adaptive resistance to KRASG12C (OFF)-only inhibitors is observed in association with increased expression and activity of KRASG12C(ON). To provide optimal KRASG12C target coverage, we have developed BBO-8520, a first-in-class, direct dual inhibitor of KRASG12C(ON) and (OFF) forms. BBO-8520 binds in the Switch-II/Helix3 pocket, covalently modifies the target cysteine and disables effector binding to KRASG12C(ON). BBO-8520 exhibits potent signaling inhibition in growth factor activated states where current (OFF)-only inhibitors demonstrate little measurable activity. In vivo, BBO-8520 demonstrates rapid target engagement and inhibition of signaling, resulting in durable tumor regression in multiple models, including those resistant to KRASG12C(OFF)-only inhibitors. BBO-8520 is in Phase 1 clinical trials in patients with KRASG12C non-small cell lung cancer (NSCLC).

Abstract Mutations in RAS and PI3Kα are major drivers of human cancer. Their interaction plays a crucial role in activating PI3Kα and amplifying the PI3K-AKT-mTOR pathway. Disrupting RAS-PI3Kα interaction enhances survival in lung and skin cancer models and reduces tumor growth and angiogenesis, although the structural details of this interaction remain unclear. Here, we present structures of KRAS, RRAS2, and MRAS bound to the catalytic subunit (p110α) of PI3Kα, elucidating the interaction interfaces and local conformational changes upon complex formation. Structural and mutational analyses highlighted key residues in RAS and PI3Kα impacting binding affinity and revealed isoform-specific differences at the interaction interface in RAS and PI3K isoforms, providing a rationale for their differential affinities. Notably, in the RAS-p110α complex structures, RAS interaction with p110α is limited to the RAS-binding domain and does not involve the kinase domain. This study underscores the pivotal role of the RAS-PI3Kα interaction in PI3Kα activation and provides a blueprint for designing PI3Kα isoform-specific inhibitors to disrupt this interaction.

Molecular testing of oncogenic RAS mutations in colorectal cancer (CRC) have led to increased identification of mutations in patients with CRC. NRAS-mutated CRC has not been well characterized because it is less common (<6%) than KRAS mutations. Here, we report a novel 10 amino acid internal tandem duplication (ITD) in NRAS, which disrupts the switch II domain, in a patient with widely disseminated CRC. Hotspot next generation sequencing of a brain metastasis identified the NRAS ITD and a TP53 missense mutation (p.P275F). Whole exome sequencing of the primary tumor and two metastatic lesions (lung and brain) confirmed that the NRAS ITD and TP53 mutation were conserved between the primary tumor and both metastatic tumors, and identified an additional pathogenic mutation in CSMD1 (a tumor suppressor gene). Structural biology and biochemical analyses demonstrated that the NRAS ITD prevented binding to GAP protein, leading to sustained RAS activation, increased interaction with RAF, and downstream MAPK activation. Additionally, we provide the first crystal structure of the RAS ITD. In conclusion, these studies indicate that the NRAS ITD was the probable primary driver mutation of this aggressive CRC. Identical or biologically similar ITDs in NRAS and KRAS may be rare drivers of CRC and other aggressive malignancies.