Summary Quantitative sub-cellular metabolomic measurements can yield crucial insights into the roles of metabolites in cellular processes, but are subject to multiple confounding factors. We developed S table I sotope L abeling of E ssential nutrients in cell C ulture – S ub-cellular F ractionation (SILEC-SF), which uses isotope labeled internal standard controls that are present throughout fractionation and processing to quantify acyl-Coenzyme A thioesters in sub-cellular compartments by liquid chromatography-mass spectrometry. We tested SILEC-SF in a range of sample types and examined the compartmentalized responses to oxygen tension, cellular differentiation, and nutrient availability. Application of SILEC-SF to the challenging analysis of the nuclear compartment revealed a nuclear acyl-CoA profile distinct from that of the cytosol, with notable nuclear enrichment of propionyl-CoA. Using isotope tracing we identified the branched chain amino acid (BCAA) isoleucine as a major metabolic source of nuclear propionyl-CoA and histone propionylation, thus revealing a new mechanism of crosstalk between metabolism and the epigenome.

SUMMARY ATR kinase is a central regulator of the DNA damage response (DDR) and cell cycle checkpoints. ATR kinase inhibitors (ATRi’s) combine with radiation to generate CD8 + T cell-dependent responses in mouse models of cancer. We show that ATRi’s induce CDK1-dependent origin firing across active replicons in CD8 + T cells activated ex vivo while simultaneously decreasing the activity of rate-limiting enzymes for nucleotide biosynthesis. These pleiotropic effects of ATRi induce deoxyuridine (dU) contamination in genomic DNA, R loops, RNA-DNA polymerase collisions, and type-1 interferons (IFN-1). Remarkably, thymidine rescues ATRi-induced dU contamination, cell death, and IFN-1 expression in proliferating CD8 + T cells. Thymidine also rescues ATRi-induced cancer cell death. We propose that ATRi-induced dU contamination contributes to dose-limiting leukocytopenia and inflammation in the clinic and CD8 + T cell dependent anti-tumor responses in mouse models. We conclude that ATR is essential to limit dU contamination in genomic DNA and IFN-1 expression.

Abstract Acetyl-Coenzyme A is a central metabolite in catabolic and anabolic pathways as well as the acyl donor for acetylation reactions. Multiple quantitative measurement techniques for acetyl-CoA have been reported, including commercially available kits. Comparisons between techniques for acetyl-CoA measurement have not been reported. This lack of comparability between assays makes context-specific assay selection and interpretation of results reporting changes in acetyl-CoA metabolism difficult. We compared commercially available colorimetric ELISA and fluorometric enzymatic-based kits to liquid chromatography-mass spectrometry-based assays using tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The colorimetric ELISA kit did not produce interpretable results even with commercially available pure standards. The fluorometric enzymatic kit produced comparable results to the LC-MS-based assays depending on matrix and extraction. LC-MS/MS and LC-HRMS assays produced well-aligned results, especially when incorporating stable isotope-labeled internal standards. In addition, we demonstrated the multiplexing capability of the LC-HRMS assay by measuring a suite of short-chain acyl-CoAs in a variety of acute myeloid leukemia cell lines and patient cells.

OBJECTIVE: The dynamic regulation of metabolic pathways can be monitored by stable isotope tracing. Yet, many metabolites are part of distinct processes within different subcellular compartments. Standard isotope tracing experiments relying on analyses in whole cells may not accurately reflect compartmentalized metabolic processes. Analysis of compartmentalized metabolism and the dynamic interplay between compartments can potentially be achieved by stable isotope tracing followed by subcellular fractionation. Although it is recognized that metabolism can take place during biochemical fractionation of cells, a clear understanding of how such post-harvest metabolism impacts the interpretation of subcellular isotope tracing data and methods to correct for this are lacking. We set out to directly assess artifactual metabolism, enabling us to develop and test strategies to correct for it. We apply these techniques to examine the compartment-specific metabolic kinetics of 13C-labeled substrates targeting central metabolic pathways. METHODS: We designed a stable isotope tracing strategy to interrogate post-harvest metabolic activity during subcellular fractionation using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). RESULTS: We show that post-harvest metabolic activity occurs rapidly (within seconds) upon cell harvest. With further characterization we reveal that this post-harvest metabolism is enzymatic, and reflects the metabolic capacity of the sub-cellular compartment analyzed; but is limited in the extent of its propagation into downstream metabolites in metabolic pathways. We also propose and test a post-labeling strategy to assess the amount of post-harvest metabolism occurring in an experiment and then to adjust data to account for this. We validate this approach for both mitochondrial and cytosolic metabolic analyses. CONCLUSIONS: Our data indicate that isotope tracing coupled with sub-cellular fractionation can reveal distinct and dynamic metabolic features of cellular compartments, and that confidence in such data can be improved by applying a post-labeling correction strategy. We examine compartmentalized metabolism of acetate and glutamine and show that acetyl-CoA is turned over rapidly in the cytosol and acts as a pacemaker of anabolic metabolism in this compartment.

Abstract Quantification of cellular deoxyribonucleoside mono-(dNMP), di-(dNDP), triphosphates (dNTPs) and related nucleoside metabolites are difficult due to their physiochemical properties and widely varying abundance. Involvement of dNTP metabolism in cellular processes including senescence and pathophysiological processes including cancer and viral infection make dNTP metabolism an important bioanalytical target. We modified a previously developed ion pairing reversed phase chromatography-mass spectrometry method for the simultaneous quantification and 13 C isotope tracing of dNTP metabolites. dNMPs, dNDPs, and dNTPs were chromatographically resolved to avoid mis-annotation of in-source fragmentation. We used commercially available 13 C 15 N-stable isotope labeled analogs as internal standards and show that this isotope dilution approach improves analytical figures of merit. At sufficiently high mass resolution achievable on an Orbitrap mass analyzer, stable isotope resolved metabolomics allows simultaneous isotope dilution quantification and 13 C isotope tracing from major substrates including 13 C-glucose. As a proof of principle, we quantified dNMP, dNDP and dNTP pools from multiple cell lines. We also identified isotopologue enrichment from glucose corresponding to ribose from the pentose-phosphate pathway in dNTP metabolites.

Abstract Metabolism of polyunsaturated fatty acids results in the formation of hydroxylated fatty acids that can be further oxidized by dehydrogenases, often resulting in the formation of electrophilic, α,β-unsaturated ketone containing fatty acids. As electrophiles are associated with redox signaling, we sought to investigate the metabolism of the oxo-fatty acid products in relation to their double bond architecture. Using an untargeted liquid chromatography mass spectrometry approach, we identified mono- and di-saturated products of the arachidonic acid-derived 11-oxoeicosatetraenoic acid (11-oxoETE) and mono-saturated metabolites of 15-oxoETE and docosahexaenoic acid-derived 17-oxodocosahexaenoinc acid (17-oxoDHA) in both human A549 lung carcinoma and umbilical vein endothelial cells. Notably, mono-saturated oxo-fatty acids maintained their electrophilicity as determined by nucleophilic conjugation to glutathione while a second saturation of 11-oxoETE resulted in a loss of electrophilicity. These results would suggest that prostaglandin reductase (PTGR1), known for its reduction of the α,β-unsaturated double bond, was not responsible for the saturation of oxo-fatty acids. Surprisingly, knockdown of PTGR1 expression by shRNA confirmed its participation in the formation of 15-oxoETE and 17-oxoDHA mono-saturated metabolites. Furthermore, overexpression of PTGR1 in A549 cells increased the rate and total amount of oxo-fatty acid saturation. These findings will further facilitate the study of electrophilic fatty acid metabolism and signaling in the context of inflammatory diseases and cancer where they have been shown to have anti-inflammatory and anti-proliferative signaling properties. Highlights Primary saturation of electrophilic fatty acids does not abolish biological activity. Prostaglandin reductase 1 reduces double bonds in fatty acids that are structurally similar to 15-keto-prostaglandin E 2 . Prostaglandin reductase 1 reduces non-carbonyl adjacent double bonds.