Although vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation is implicated in atherogenesis, VSMCs in advanced plaques and cultured from plaques show evidence of VSMC senescence and DNA damage. In particular, plaque VSMCs show shortening of telomeres, which can directly induce senescence. Senescence can have multiple effects on plaque development and morphology; however, the consequences of VSMC senescence or the mechanisms underlying VSMC senescence in atherosclerosis are mostly unknown.We examined the expression of proteins that protect telomeres in VSMCs derived from human plaques and normal vessels. Plaque VSMCs showed reduced expression and telomere binding of telomeric repeat-binding factor-2 (TRF2), associated with increased DNA damage. TRF2 expression was regulated by p53-dependent degradation of the TRF2 protein. To examine the functional consequences of loss of TRF2, we expressed TRF2 or a TRF2 functional mutant (T188A) as either gain- or loss-of-function studies in vitro and in apolipoprotein E(-/-) mice. TRF2 overexpression bypassed senescence, reduced DNA damage, and accelerated DNA repair, whereas TRF2(188A) showed opposite effects. Transgenic mice expressing VSMC-specific TRF2(T188A) showed increased atherosclerosis and necrotic core formation in vivo, whereas VSMC-specific TRF2 increased the relative fibrous cap and decreased necrotic core areas. TRF2 protected against atherosclerosis independent of secretion of senescence-associated cytokines.We conclude that plaque VSMC senescence in atherosclerosis is associated with loss of TRF2. VSMC senes cence promotes both atherosclerosis and features of plaque vulnerability, identifying prevention of senescence as a potential target for intervention.

ABSTRACT Rationale Vascular smooth muscle cell (VSMC) dysregulation is a hallmark of vascular disease, including atherosclerosis. In particular, the majority of cells within atherosclerotic lesions are generated from pre-existing VSMCs and a clonal nature has been documented for VSMC-derived cells in multiple disease models. However, the mechanisms underlying the generation of oligoclonal lesions and the phenotype of proliferating VSMCs are unknown. Objective To understand the cellular mechanisms underlying clonal VSMC expansion in disease. Methods and Results Here we analyse clonal dynamics in multi-color lineage-traced animals over time after vessel injury. We demonstrate that VSMC proliferation is initiated in a small fraction of VSMCs that initially expand clonally in the medial layer and then migrate to form the oligoclonal neointima. Selective activation of VSMC proliferation also occurs in vitro , suggesting that this is a cell-autonomous feature. Mapping of VSMC trajectories using single-cell RNA-sequencing reveals a continuum of cellular states after injury and suggests that VSMC proliferation initiates in cells that have downregulated the contractile phenotype and show evidence of pronounced phenotypic switching. We show that proliferation is associated with induced expression of stem cell antigen 1 (SCA1) and the expression signature previously identified in SCA1+ VSMCs in healthy arteries. A remarkably increased proliferation of SCA1+ VSMCs, directly validated in functional assays, indicates that SCA1+ VSMCs act as “first responders” in vascular injury. Early atherosclerotic lesions also had clonal VSMC contribution and we show that the proliferation-associated injury response is conserved in plaque VSMCs, extending these findings to atherosclerosis. Finally, we identify VSMCs in healthy human arteries that correspond to the SCA1+ state in mouse VSMCs and show that genes identified as differentially expressed in this human VSMC subpopulation are enriched for genes showing genetic association with cardiovascular disease. Conclusions We show that cell-intrinsic, selective VSMC activation drives clonal proliferation after injury and in atherosclerosis. Our study suggests that healthy mouse and human arteries contain VSMCs characterised by expression of disease-associated genes that are predisposed for proliferation. Targeting such “first responder” cells in patients undergoing vascular surgery could effectively prevent injury-associated VSMC activation and neoatherosclerosis.

Abstract Genome and epigenome integrity in eukaryotes depends on the proper coupling of histone deposition with DNA synthesis. This process relies on the evolutionary conserved histone chaperone CAF-1 for which the links between structure and functions are still a puzzle. While studies of the S. cerevisiae CAF-1 complex enabled to propose a model for the histone deposition mechanism, we still lack a framework to demonstrate its generality and in particular, how its interaction with the polymerase accessory factor PCNA is operating. Here, we reconstituted a complete Sp CAF-1 from fission yeast. We characterized its dynamic structure using NMR, SAXS and molecular modeling together with in vitro and in vivo functional studies on rationally designed interaction mutants. Importantly, we identify the unfolded nature of the acidic domain which folds up when binding to histones. We also show how the long KER helix mediates DNA binding and stimulates Sp CAF-1 association with PCNA. Our study highlights how the organization of CAF-1 comprising both disordered regions and folded modules enables the dynamics of multiple interactions to promote synthesis-coupled histone deposition essential for its DNA replication, heterochromatin maintenance, and genome stability functions.

Intro: Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation following endovascular interventions leads to restenosis, treated with drug-eluting stents. However, current drugs completely abolish vascular healing, cause thrombosis and clinical events. PCSK6 is a key protease in vascular remodeling and VSMCs activation upon vessel injury, via regulation of MMP2/14 activity. Here, we investigate whether local PCSK6 inhibition reduces VSMC proliferation and intimal hyperplasia. Methods: PCSK6 peptide inhibitor was tested in vitro on VSMCs migration, proliferation, apoptosis in comparison to rapamycin and paclitaxel. Internalization of a FITC labelled inhibitor was studied by flow cytometry and immunofluorescence. In vivo , PCSK6 inhibitor was administered at 3mg/kg IP using cationic microbubbles, followed by ultrasound-mediated local delivery in mice developing intimal hyperplasia after carotid ligation (n=8 vs 11). Carotid ligation in Tagln Cre+ /Pcsk6 fl/fl mice investigated the effect of PCSK6 specific ablation in VSMCs on intimal hyperplasia (n=7 vs 9). Carotids were collected from these and constitutive Pcsk6 -/- mice vs. controls for transcriptomic and histological analyses. Results: In vitro , PCSK6 inhibitor was internalized and inhibited both VSMC migration and proliferation (p<0.0001), reducing the expression of PCSK6, MMP2 and GDF15 . In comparison, paclitaxel showed severe VSMC toxicity, whereas rapamycin inhibited more strongly VSMC migration and proliferation than the PCSK6 inhibitor. In vivo, the inhibitor reduced intimal hyperplasia (p=0.026), again, by repressing PCSK6 and MMP2 expression in treated vs. control mice, with a favorable safety profile. Likewise, conditional VSMC Pcsk6 knockouts showed less intimal hyperplasia (p=0.053). In carotids from Pcsk6 -/- mice, cytoskeletal (Synm) and peptidase (Pgpep1l, Klk1) genes were strongly downregulated, showing its importance for vascular matrix composition. Conclusion: Our proof-of-concept translational study shows that local application of a PCSK6 inhibitor is a viable method for specifically modulating VSMC activation in intimal hyperplasia following vascular injury