Abstract Increasing drought stress poses a severe threat to agricultural productivity. Plants, however, evolved numerous mechanisms to cope with such environmental stress. Here we report that the stress-induced production of a peptide signal contributes to stress tolerance. The expression of phytosulfokine (PSK) peptide precursor genes, and transcripts of three subtilisin-like serine proteases, SBT1.4, SBT3.7 and SBT3.8 were found to be up-regulated in response to osmotic stress. Stress symptoms were enhanced in sbt3.8 loss-of-function mutants and could be alleviated by PSK treatment. Osmotic stress tolerance was improved in plants overexpression the precursor of PSK1 ( proPSK1 ) or SBT3.8 resulting in higher fresh weight and improved lateral root development in the transgenic compared to wild-type plants. We further showed that SBT3.8 is involved in the biogenesis of the bioactive PSK peptide. ProPSK1 was cleaved by SBT3.8 at the C-terminus of the PSK pentapeptide. Processing by SBT3.8 depended on the aspartic acid residue adjacent to the cleavage site. ProPSK1 processing was impaired in the sbt3.8 mutant. The data suggest that increased expression in response to osmotic stress followed by the post-translational processing of proPSK1 by SBT3.8 leads to the production of PSK as a peptide signal for stress mitigation. Highlight The expression of phytosulfokine precursor genes and processing by the subtilase SBT3.8 are upregulated in response to osmotic stress for improved drought tolerance in Arabidopsis.

Abstract Post-translationally modified peptides are involved in many aspects of plant growth and development. The maturation of these peptides from their larger precursors is still poorly understood. We show here that the biogenesis of CLEL6 and CLEL9 peptides in Arabidopsis thaliana requires a series of processing events in consecutive compartments of the secretory pathway. Following cleavage of the signal peptide upon entry into the endoplasmic reticulum (ER), the peptide precursors are processed in the cis-Golgi by the subtilase SBT6.1. SBT6.1-mediated cleavage within the variable domain allows for continued passage of the partially processed precursors through the secretory pathway, and is a prerequisite for subsequent post-translational modifications including tyrosine sulfation and proline hydroxylation within, and proteolytic maturation after exit from the Golgi. Activation by subtilase SBT3.8 in post-Golgi compartments depends on the N-terminal aspartate of the mature peptides. Our work highlights the complexity of post-translational precursor maturation allowing for stringent control of peptide biogenesis.

Abstract Post-translationally modified peptides are now recognized as important regulators of plant stress responses. Here we identified the small sulfated CLE-LIKE6 (CLEL6) peptide as a negative regulator of stress-induced anthocyanin biosynthesis. The expression of CLEL6 and its negative effect on anthocyanin biosynthesis were strongly down-regulated by light. The function of CLEL6 depends on proteolytic processing of the CLEL6 precursor by the subtilisin-like serine proteinase 6.1 (SBT6.1), and on tyrosine sulfation by tyrosylprotein sulfotransferase (TPST). Loss of function mutants of either sbt6.1 or tpst showed significantly higher anthocyanin accumulation upon light stress. The overaccumulation phenotype of sbt6.1 and tpst was suppressed by application of mature CLEL6. Further confirming the role of CLEL6 as an inhibitor of anthocyanin biosynthesis, overexpression and external application of CLEL6 inhibited the expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in etiolated and light-stressed seedlings. Small post-translationally modified peptides are known to be perceived by leucine-rich-repeat receptor like kinases. Through a genetic approach, using a ROOT MERISTEM GROWTH FACTOR 1 INSENSITIVE (RGI) receptor quintuple mutant, we could show the essential function of the RGI receptor family in CLEL6 signaling. Our data indicate that CLEL6 inhibits anthocyanin biosynthesis through RGI receptors in dark-grown seedlings, and that this inhibition is released when CLEL6 expression is down-regulated upon transition to light. One sentence summary The formation of CLEL6 as a negative regulator of anthocyanin biosynthesis depends on proteolytic processing by SBT6.1, post-translational modification by TPST, and perception by RGI receptors.

Abstract The surface of pollen grains is reinforced by pollen wall components produced non-cell autonomously by tapetum cells that surround developing pollen within the male floral organ, the anther. Here we show that tapetum activity is regulated by the GASSHO (GSO) receptor-like kinase pathway, controlled by two sulfated peptides, CASPARIAN STRIP INTEGRITY FACTOR 3 (CIF3) and CIF4, the precursors of which are expressed in the tapetum itself. Coordination of tapetum activity with pollen grain development depends on the action of subtilases, including AtSBT5.4, which are produced stage-specifically by developing pollen grains. Tapetum-derived CIF precursors are processed by subtilases, triggering GSO-dependent tapetum activation. We show that the GSO receptors act from the middle layer, a tissue surrounding the tapetum and developing pollen. Three concentrically organized cell types therefore cooperate to coordinate pollen wall deposition through a multilateral molecular dialog. Significance Statement Pollen viability depends on a tough external barrier called the pollen wall. Pollen wall components are produced by tapetum cells which surround developing pollen grains within the anther. Precise coordination of tapetum activity with pollen grain development is required to ensure effective pollen wall formation. Here we reveal that this is achieved through a multidirectional dialogue involving three distinct cell types. We show that peptide precursors from the tapetum are activated by proteases produced stage-specifically in developing pollen grains. Unexpectedly, we found that activated peptides are perceived not in the tapetum, but in the middle layer, which encloses the developing tapetum and pollen grains, revealing an unsuspected role for this enigmatic cell layer in the control of tapetum development.

Abstract The nuclear lamina (NL) is a complex network of nuclear lamins and lamin-associated nuclear membrane proteins, which scaffold the nucleus to maintain structural integrity. In Arabidopsis thaliana, Nuclear Matrix Constituent Proteins (NMCPs) are essential components of the NL and are required to maintain the structural integrity of the nucleus and specific perinuclear chromatin anchoring. At the nuclear periphery, suppressed chromatin overlapping with repetitive sequences and inactive protein coding genes are enriched. At a chromosomal level, plant chromatin organization in interphase nuclei displays flexibilities in response to various developmental cues and environmental stimuli. Based on these observations in Arabidopsis , and given the role of AtNMCP genes ( CRWN1 and CRWN4 ) in organizing chromatin positioning at the nuclear periphery, one can expect considerable changes in chromatin-NL interactions when the global chromatin organization patterns are being altered in plants. Here, we report the highly flexible nature of plant nuclear lamina, which disassembles substantially under various stress conditions. Particularly, under heat stress, we reveal that chromatin domains, initially tethered to the nuclear envelope, remain largely associated with CRWN1 and become scattered in the inner nuclear space. Via investigating the three-dimensional chromatin contact network, we further reveal that CRWN1 proteins play a structural role in shaping the changes in genome folding under heat stress. Also, CRWN1 acts as a negative transcriptional co-regulator to modulate the shift of the plant transcriptome profile in response to heat stress.

Summary The hemiparasitic plant Phtheirospermum japonicum is a nutritional specialist that supplements its nutrient requirements by parasitizing other plants through haustoria. During parasitism, the Phtheirospermum haustorium transfers hypertrophy-inducing cytokinins (CKs) to the infected host root. The CK biosynthesis genes required for haustorium-derived CKs and the induction of hypertrophy are still unknown. We searched for haustorium-expressed isopentenyltransferases (IPTs) that catalyse the first step of CK biosynthesis, confirmed the specific expression by in vivo imaging of a promoter-reporter, and further analysed the subcellular localization, the enzymatic function, and contribution to inducing hypertrophy by studying CRISPR-Cas9 induced Phtheirospermum mutants. PjIPT1a was expressed in intrusive cells of the haustorium close to the host vasculature. PjIPT1a and its closest homolog PjIPT1b located to the cytosol and showed isopentenyltransferases activity in vitro with differences in substrate specificity. Mutating PjIPT1a abolished parasite-induced CK responses in the host. A homolog of PjIPT1a with shared characteristics was also identified in the related weed Striga hermonthica . We propose that PjIPT1a exemplifies how parasitism-related functions evolve through gene duplications and neofunctionalization.

Systemin is a small peptide with important functions in plant wound response signaling. Although transcriptional responses of systemin action are well described, the precise signaling cascades involved in its perception and signal transduction are poorly understood at the protein level. Here we use a phosphoproteomic profiling study involving stimulation time courses with systemin and its inactive analogon A17 to reconstruct a systemin-specific kinase/phosphatase signaling network. The time course analysis of systemin-induced phosphorylation patterns revealed early events at the plasma membrane, such as dephosphorylation of H+-ATPase, rapid phosphorylation of NADPH-oxidase and Ca2+-ATPase. Later responses involved transient phosphorylation of small GTPases and vesicle trafficking proteins, as well as transcription factors. Based on a correlation analysis of systemin-specific phosphorylation profiles, we predict substrate candidates for 44 systemin specific kinases and 9 phosphatases. Among the kinases are several systemin-specific receptor kinases as well as kinases with downstream signaling functions, such as MAP-kinases. A regulatory circuit for plasma membrane H+-ATPase was predicted and confirmed by in-vitro activity assays. In this regulatory model we propose that upon systemin treatment, H+-ATPase LHA1 is rapidly de-phosphorylated at its C-terminal regulatory residue T955 by phosphatase PLL5, resulting in the alkalization of the growth medium within two minutes of systemin treatment. We further propose that the H+-ATPase LHA1 is re-activated by MAP-Kinase MPK2 later in the systemin response. MPK2 was identified with increased phosphorylation at its activating TEY-motif at 15 minutes of treatment and the predicted interaction with LHA1 was confirmed by in-vitro kinase assays. Our data set provides a valuable resource of proteomic events involved in the systemin signaling cascade with a focus on predictions of substrates to systemin-specific kinases and phosphatases.

Parasitic plants that infect crops are devastating to agriculture throughout the world. They develop a unique inducible organ called the haustorium, which connects the vascular systems of the parasite and host to establish a flow of water and nutrients. Upon contact with the host, the haustorial epidermal cells at the interface with the host differentiate into specific cells called intrusive cells that grow endophytically towards the host vasculature. Then, some of the intrusive cells re-differentiate to form a xylem bridge that connects the vasculatures of the parasite and host. Despite the prominent role of intrusive cells in host infection, the molecular mechanisms mediating parasitism in the intrusive cells are unknown. In this study, we investigated differential gene expression in the intrusive cells of the facultative parasite Phtheirospermum japonicum in the family Orobanchaceae by RNA-Sequencing of laser-microdissected haustoria. We then used promoter analyses to identify genes that are specifically induced in intrusive cells, and used promoter fusions with genes encoding fluorescent proteins to develop intrusive cell-specific markers. Four of the intrusive cell-specific genes encode subtilisin-like serine proteases (SBTs), whose biological functions in parasitic plants are unknown. Expression of an SBT inhibitor in the intrusive cells inhibited their development, inhibited the development of the xylem bridge, and reduced auxin response levels near the site where the xylem bridge normally develops. Therefore, we propose that subtilase activity plays an important role in haustorium development in this parasitic plant.

Phytocytokines are hormone-like plant peptides that modulate immune homeostasis and development. Phytosulfokine (PSK) mediates plant growth and attenuates activation of plant pattern-triggered immunity (PTI). We show that the small cysteine-containing effector VdSCP8 from Verticillium dahliae (Vd) is a virulence-promoting protein that suppresses PTI in Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana. Apoplastic SCP8 suppresses immune activation through leucine-rich repeat ectodomain pattern recognition receptors. SCP8 virulence and immunosuppressive activities require PHYTOSULFOKINE RECEPTOR 1 (PSKR1), which binds PSK and forms a complex with co-receptor BAK1 for PTI suppression. We find that PSK, like SCP8, suppresses PTI, SCP8 stimulates PSKR1-BAK1 complex formation, and that Vd requires PSK signaling for host infection. SCP8 interacts with an apoplastic subtilase, and co-expression of SCP8 and subtilase inhibitors reduces PTI suppression. Our findings suggest that a multi-host plant pathogen manipulates PTI by enhancing immunosuppressive PSK signaling, likely through plant subtilase activity.