Ovarian clear-cell and endometrioid carcinomas may arise from endometriosis, but the molecular events involved in this transformation have not been described.We sequenced the whole transcriptomes of 18 ovarian clear-cell carcinomas and 1 ovarian clear-cell carcinoma cell line and found somatic mutations in ARID1A (the AT-rich interactive domain 1A [SWI-like] gene) in 6 of the samples. ARID1A encodes BAF250a, a key component of the SWI–SNF chromatin remodeling complex. We sequenced ARID1A in an additional 210 ovarian carcinomas and a second ovarian clear-cell carcinoma cell line and measured BAF250a expression by means of immunohistochemical analysis in an additional 455 ovarian carcinomas.ARID1A mutations were seen in 55 of 119 ovarian clear-cell carcinomas (46%), 10 of 33 endometrioid carcinomas (30%), and none of the 76 high-grade serous ovarian carcinomas. Seventeen carcinomas had two somatic mutations each. Loss of the BAF250a protein correlated strongly with the ovarian clear-cell carcinoma and endometrioid carcinoma subtypes and the presence of ARID1A mutations. In two patients, ARID1A mutations and loss of BAF250a expression were evident in the tumor and contiguous atypical endometriosis but not in distant endometriotic lesions.These data implicate ARID1A as a tumor-suppressor gene frequently disrupted in ovarian clear-cell and endometrioid carcinomas. Since ARID1A mutation and loss of BAF250a can be seen in the preneoplastic lesions, we speculate that this is an early event in the transformation of endometriosis into cancer. (Funded by the British Columbia Cancer Foundation and the Vancouver General Hospital–University of British Columbia Hospital Foundation.).

Extensive genomic characterization of human cancers presents the problem of inference from genomic abnormalities to cancer phenotypes. To address this problem, we analysed proteomes of colon and rectal tumours characterized previously by The Cancer Genome Atlas (TCGA) and perform integrated proteogenomic analyses. Somatic variants displayed reduced protein abundance compared to germline variants. Messenger RNA transcript abundance did not reliably predict protein abundance differences between tumours. Proteomics identified five proteomic subtypes in the TCGA cohort, two of which overlapped with the TCGA 'microsatellite instability/CpG island methylation phenotype' transcriptomic subtype, but had distinct mutation, methylation and protein expression patterns associated with different clinical outcomes. Although copy number alterations showed strong cis- and trans-effects on mRNA abundance, relatively few of these extend to the protein level. Thus, proteomics data enabled prioritization of candidate driver genes. The chromosome 20q amplicon was associated with the largest global changes at both mRNA and protein levels; proteomics data highlighted potential 20q candidates, including HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4, alpha), TOMM34 (translocase of outer mitochondrial membrane 34) and SRC (SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase). Integrated proteogenomic analysis provides functional context to interpret genomic abnormalities and affords a new paradigm for understanding cancer biology.

Remodeling Gone Awry The identification of genes that are mutated at high frequency in human tumors can provide important clues to the molecular pathways that drive tumor growth, which in turn can potentially lead to more effective therapies. Jones et al. (p. 228 , published online 9 September; see the cover) looked for such mutations in ovarian clear cell carcinoma, a rare but particularly lethal form of ovarian cancer. Of 42 tumors examined, 57% were found to harbor inactivating mutations in ARID1A , a gene coding for a subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, which functions as a master regulator of transcription factor action and gene expression. Thus, proteins associated with the epigenetic control of gene expression can contribute to the development of human cancer.

Abstract Background: Updated National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) Laboratory Medicine Practice Guidelines for the use of tumor markers in the clinic have been developed. Methods: Published reports relevant to use of tumor markers for 5 cancer sites—testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian—were critically reviewed. Results: For testicular cancer, α-fetoprotein, human chorionic gonadotropin, and lactate dehydrogenase are recommended for diagnosis/case finding, staging, prognosis determination, recurrence detection, and therapy monitoring. α-Fetoprotein is also recommended for differential diagnosis of nonseminomatous and seminomatous germ cell tumors. Prostate-specific antigen (PSA) is not recommended for prostate cancer screening, but may be used for detecting disease recurrence and monitoring therapy. Free PSA measurement data are useful for distinguishing malignant from benign prostatic disease when total PSA is <10 μg/L. In colorectal cancer, carcinoembryonic antigen is recommended (with some caveats) for prognosis determination, postoperative surveillance, and therapy monitoring in advanced disease. Fecal occult blood testing may be used for screening asymptomatic adults 50 years or older. For breast cancer, estrogen and progesterone receptors are mandatory for predicting response to hormone therapy, human epidermal growth factor receptor-2 measurement is mandatory for predicting response to trastuzumab, and urokinase plasminogen activator/plasminogen activator inhibitor 1 may be used for determining prognosis in lymph node–negative patients. CA15-3/BR27–29 or carcinoembryonic antigen may be used for therapy monitoring in advanced disease. CA125 is recommended (with transvaginal ultrasound) for early detection of ovarian cancer in women at high risk for this disease. CA125 is also recommended for differential diagnosis of suspicious pelvic masses in postmenopausal women, as well as for detection of recurrence, monitoring of therapy, and determination of prognosis in women with ovarian cancer. Conclusions: Implementation of these recommendations should encourage optimal use of tumor markers.

High-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is the most frequent type of ovarian cancer and has a poor outcome. It has been proposed that fallopian tube cancers may be precursors of HGSOC but evolutionary evidence for this hypothesis has been limited. Here, we perform whole-exome sequence and copy number analyses of laser capture microdissected fallopian tube lesions (p53 signatures, serous tubal intraepithelial carcinomas (STICs), and fallopian tube carcinomas), ovarian cancers, and metastases from nine patients. The majority of tumor-specific alterations in ovarian cancers were present in STICs, including those affecting TP53, BRCA1, BRCA2 or PTEN. Evolutionary analyses reveal that p53 signatures and STICs are precursors of ovarian carcinoma and identify a window of 7 years between development of a STIC and initiation of ovarian carcinoma, with metastases following rapidly thereafter. Our results provide insights into the etiology of ovarian cancer and have implications for prevention, early detection and therapeutic intervention of this disease.

The gene encoding ARID1A, a chromatin remodeler, shows one of the highest mutation rates across many cancer types. Notably, ARID1A is mutated in over 50% of ovarian clear cell carcinomas, which currently have no effective therapy. To date, clinically applicable targeted cancer therapy based on ARID1A mutational status has not been described. Here we show that inhibition of the EZH2 methyltransferase acts in a synthetic lethal manner in ARID1A-mutated ovarian cancer cells and that ARID1A mutational status correlated with response to the EZH2 inhibitor. We identified PIK3IP1 as a direct target of ARID1A and EZH2 that is upregulated by EZH2 inhibition and contributed to the observed synthetic lethality by inhibiting PI3K-AKT signaling. Importantly, EZH2 inhibition caused regression of ARID1A-mutated ovarian tumors in vivo. To our knowledge, this is the first data set to demonstrate a synthetic lethality between ARID1A mutation and EZH2 inhibition. Our data indicate that pharmacological inhibition of EZH2 represents a novel treatment strategy for cancers involving ARID1A mutations.

BACKGROUND: Malignant cells must maintain their telomeres, but genetic mechanisms responsible for telomere maintenance in tumors have only recently been discovered. In particular, mutations of the telomere binding proteins alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked (ATRX) or death-domain associated protein (DAXX) have been shown to underlie a telomere maintenance mechanism not involving telomerase (alternative lengthening of telomeres), and point mutations in the promoter of the telomerase reverse transcriptase (TERT) gene increase telomerase expression and have been shown to occur in melanomas. METHODS: To further define the tumor types in which TERT plays a role, we surveyed 1,230 tumors of 60 different types. We also analyzed the relationship between median overall survival (OS) of patients with IDH1/2 and TERT promoter mutations in a panel of 473 adult gliomas with the hypothesis that genetic signatures capable of distinguishing among several types of gliomas could be established providing clinically relevant information that can serve as an adjunct to histopathological diagnosis. RESULTS: We found that tumors could be divided into types with low and high frequencies of TERT promoter mutations. The nine TERT-high tumor types almost always originated in tissues with relatively low rates of self renewal, including melanomas, liposarcomas, hepatocellular carcinomas, urothelial carcinomas, squamous cell carcinomas of the tongue, medulloblastomas, and subtypes of gliomas. TERT and ATRX mutations were mutually exclusive, suggesting that these two genetic mechanisms confer equivalent selective growth advantages. We found that mutations in the TERT promoter occurred in 74.2% of glioblastomas (GBM), but occurred in a minority of Grade II-III astrocytomas (18.2%). In contrast, IDH1/2 mutations were observed in 78.4% of Grade II-III astrocytomas, but were uncommon in primary GBM. In oligodendrogliomas, TERT promoter and IDH1/2 mutations co-occurred in 79% of cases. Patients whose Grade III-IV gliomas exhibit TERT promoter mutations alone predominately have primary GBMs associated with poor median OS rates (11.5 months). Patients whose gliomas exhibit IDH1/2 mutations alone predominately have astrocytic morphologies and exhibit a median OS of 57 months while patients whose tumors exhibit both TERT promoter and IDH1/2 mutations predominately exhibit oligodendroglial morphologies and exhibit median OS of 125 months. CONCLUSIONS: In addition to their implications for understanding the relationship between telomeres and tumorigenesis, TERT mutations provide a biomarker that may aid in the classification and prognostication of brain tumors. SECONDARY CATEGORY: Tumor Biology.

Immunohistochemical staining for p53 is used as a surrogate for mutational analysis in the diagnostic workup of carcinomas of multiple sites including ovarian cancers. Strong and diffuse immunoexpression of p53 is generally interpreted as likely indicating a TP53 gene mutation. The immunoprofile that correlates with wild-type TP53, however, is not as clear. In particular, the significance of completely negative immunostaining is controversial. The aim of this study was to clarify the relationship of the immunohistochemical expression of p53 with the mutational status of the TP53 gene in ovarian cancer. A total of 57 ovarian carcinomas (43 high-grade serous ovarian/peritoneal carcinomas, 2 malignant mesodermal mixed tumors (carcinosarcomas), 2 low-grade serous carcinomas, 4 clear cell carcinomas, 1 well-differentiated endometrioid carcinoma, and 5 carcinomas with mixed epithelial differentiation) were analyzed for TP53 mutations by nucleotide sequencing (exons 4–9), and subjected to immunohistochemical analysis of p53 expression. Thirty six tumors contained functional mutations and 13 had wild type TP53. Five tumors were found to harbor known TP53 polymorphism and changes in the intron region were detected in three. Tumors with wild-type TP53 displayed a wide range of immunolabeling patterns, with the most common pattern showing ≤10% of positive cells in 6 cases (46%). Mutant TP53 was associated with 60–100% positive cells in 23 cases (64% of cases). This pattern of staining was also seen in three cases with wild-type TP53. Tumors that were completely negative (0% cells staining) had a mutation of TP53 in 65% of cases and wild-type TP53 in 11%. Combining two immunohistochemical labeling patterns associated with TP53 mutations (0% and 60–100% positive cells), correctly identified a mutation in 94% of cases (P<0.001). Immunohistochemical analysis can be used as a robust method for inferring the presence of a TP53 mutation in ovarian carcinomas. In addition to a strong and diffuse pattern of p53 expression (in greater than 60% of cells), complete absence of p53 immunoexpression is commonly associated with a TP53 mutation. Accordingly, this latter pattern, unlike low-level expression (10–50% cells), should not be construed as indicative of wild-type TP53.

Approximately 10% to 15% of human cancers lack detectable telomerase activity, and a subset of these maintain telomere lengths by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT). The ALT phenotype, relatively common in subtypes of sarcomas and astrocytomas, has rarely been reported in epithelial malignancies. However, the prevalence of ALT has not been thoroughly assessed across all cancer types. We therefore comprehensively surveyed the ALT phenotype in a broad range of human cancers. In total, two independent sets comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes, 541 benign neoplasms, and 264 normal tissue samples were assessed by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence labeling for PML protein. Overall, ALT was observed in 3.73% (228/6110) of all tumor specimens, but was not observed in benign neoplasms or normal tissues. This is the first report of ALT in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. Additionally, this is the first report of ALT in medulloblastomas, oligodendrogliomas, meningiomas, schwannomas, and pediatric glioblastoma multiformes. Previous studies have shown associations between ALT status and prognosis in some tumor types; thus, further studies are warranted to assess the potential prognostic significance and unique biology of ALT-positive tumors. These findings may have therapeutic consequences, because ALT-positive cancers are predicted to be resistant to anti-telomerase therapies. Approximately 10% to 15% of human cancers lack detectable telomerase activity, and a subset of these maintain telomere lengths by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT). The ALT phenotype, relatively common in subtypes of sarcomas and astrocytomas, has rarely been reported in epithelial malignancies. However, the prevalence of ALT has not been thoroughly assessed across all cancer types. We therefore comprehensively surveyed the ALT phenotype in a broad range of human cancers. In total, two independent sets comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes, 541 benign neoplasms, and 264 normal tissue samples were assessed by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence labeling for PML protein. Overall, ALT was observed in 3.73% (228/6110) of all tumor specimens, but was not observed in benign neoplasms or normal tissues. This is the first report of ALT in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. Additionally, this is the first report of ALT in medulloblastomas, oligodendrogliomas, meningiomas, schwannomas, and pediatric glioblastoma multiformes. Previous studies have shown associations between ALT status and prognosis in some tumor types; thus, further studies are warranted to assess the potential prognostic significance and unique biology of ALT-positive tumors. These findings may have therapeutic consequences, because ALT-positive cancers are predicted to be resistant to anti-telomerase therapies. Telomeres are the nucleoprotein complexes located at the extreme ends of eukaryotic chromosomes; they consist of 5 to 10 kb of the repeating hexanucleotide DNA sequence TTAGGG.1Blackburn E.H. Structure and function of telomeres.Nature. 1991; 350: 569-573Crossref PubMed Scopus (3060) Google Scholar, 2Moyzis R.K. Buckingham J.M. Cram L.S. Dani M. Deaven L.L. Jones M.D. Meyne J. Ratliff R.L. Wu J.R. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes.Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85: 6622-6626Crossref PubMed Scopus (1867) Google Scholar The shelterin complex, a core set of six proteins integral for telomere function, associates with these repetitive DNA regions.3Palm W. de Lange T. How shelterin protects mammalian telomeres.Annu Rev Genet. 2008; 42: 301-334Crossref PubMed Scopus (1384) Google Scholar, 4de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres.Genes Dev. 2005; 19: 2100-2110Crossref PubMed Scopus (2271) Google Scholar Telomeres function primarily to mask double-strand break DNA damage signals at chromosomal termini, inhibit terminal exonucleolytic degradation, and prevent chromosomal fusions.5de Lange T. How telomeres solve the end-protection problem.Science. 2009; 326: 948-952Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar, 6O'Sullivan R.J. Karlseder J. Telomeres: protecting chromosomes against genome instability.Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11: 171-181Crossref PubMed Google Scholar In normal somatic cells, telomeres shorten with each cell division, and significant telomere shortening leads to p53-dependent senescence or apoptosis.7Vaziri H. Critical telomere shortening regulated by the ataxia-telangiectasia gene acts as a DNA damage signal leading to activation of p53 protein and limited life-span of human diploid fibroblasts A review.Biochemistry (Mosc). 1997; 62: 1306-1310PubMed Google Scholar As a result, there is a limited number of population doublings that a somatic cell lineage may undergo, at which point further proliferative expansion is blocked. During malignant transformation, these cell cycle checkpoints are abrogated (eg, through mutations in tumor suppressor proteins). If cellular proliferation continues unchecked, then genomic instability may ensue via chromosomal breakage-fusion-bridge cycles caused by eroded, dysfunctional telomeres.8Maser R.S. DePinho R.A. Connecting chromosomes, crisis, and cancer.Science. 2002; 297: 565-569Crossref PubMed Scopus (485) Google Scholar In 85% to 90% of human cancers, telomere dysfunction is attenuated and telomere length appears to be maintained, or increased, through up-regulation of the enzyme telomerase, a reverse transcriptase with the ability to synthesize new telomere DNA using an internal RNA template.9Shay J.W. Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer. 1997; 33: 787-791Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2389) Google Scholar However, telomere loss may also be compensated in some cancers by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT), which is thought to be dependent on homologous recombination.10Bryan T.M. Englezou A. Dalla-Pozza L. Dunham M.A. Reddel R.R. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines.Nat Med. 1997; 3: 1271-1274Crossref PubMed Scopus (1026) Google Scholar The ALT phenotype is identified at the cellular level by the presence of ALT-associated promyelocytic leukemia (PML) protein nuclear bodies (APBs) that contain large amounts of telomeric DNA, in addition to PML protein and other proteins involved in telomere binding, DNA replication, and recombination.11Royle N.J. Foxon J. Jeyapalan J.N. Mendez-Bermudez A. Novo C.L. Williams J. Cotton V.E. Telomere length maintenance–an ALTernative mechanism.Cytogenet Genome Res. 2008; 122: 281-291Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 12Cesare A.J. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.Nat Rev Genet. 2010; 11: 319-330Crossref PubMed Scopus (673) Google Scholar ALT-positive cells are characterized by striking telomere length heterogeneity, as well as increased chromosomal instability. APBs are cancer-specific and, in fixed tissues, can be visualized by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence labeling for PML protein.13Meeker A.K. Gage W.R. Hicks J.L. Simon I. Coffman J.R. Platz E.A. March G.E. De Marzo A.M. Telomere length assessment in human archival tissues: combined telomere fluorescence in situ hybridization and immunostaining.Am J Pathol. 2002; 160: 1259-1268Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar, 14Montgomery E. Argani P. Hicks J.L. DeMarzo A.M. Meeker A.K. Telomere lengths of translocation-associated and nontranslocation-associated sarcomas differ dramatically.Am J Pathol. 2004; 164: 1523-1529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (75) Google Scholar This method has been extensively validated and allows for straightforward identification of ALT-positive cancers in fixed human tissue specimens.15Henson J.D. Hannay J.A. McCarthy S.W. Royds J.A. Yeager T.R. Robinson R.A. Wharton S.B. Jellinek D.A. Arbuckle S.M. Yoo J. Robinson B.G. Learoyd D.L. Stalley P.D. Bonar S.F. Yu D. Pollock R.E. Reddel R.R. A robust assay for alternative lengthening of telomeres in tumors shows the significance of alternative lengthening of telomeres in sarcomas and astrocytomas.Clin Cancer Res. 2005; 11: 217-225PubMed Google Scholar The ALT phenotype is common among certain sarcomas (eg, osteosarcomas and liposarcomas), as well as in subsets of central nervous system tumors, including astrocytomas16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar; however, the prevalence of ALT varies widely among these different tumor types. Our laboratory recently reported the presence of ALT in a small subset of breast carcinomas,17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar but the ALT phenotype has rarely been reported in other epithelial malignancies.16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar We have comprehensively surveyed the ALT phenotype in two independent sets of fixed specimens, comprising a total of 6110 primary tumors from a broad range of human cancer subtypes. Overall, the prevalence of the ALT phenotype is 3.73%; however, the prevalence varies drastically between different subtypes. Here, we describe the results of this extensive survey, including the novel finding of the ALT phenotype in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. In addition, this is the first report of the ALT phenotype in several tumor types of nonepithelial origin, including medulloblastomas, pediatric glioblastomas multiformes (GBMs), oligodendrogliomas, meningiomas, and schwannomas. Two independent sets of primary tumor tissues were used in the present study. Set 1 consisted of 4001 tumors from 68 different cancer subtypes. The vast majority of these cases were resected and processed at the Johns Hopkins Hospital and were arrayed in tissue microarray (TMA) format. This set consisted of 165 TMAs containing multiple cores of each tumor specimen and, in most instances, adjacent normal tissue. In addition to these TMAs from our institution, seven TMAs containing 195 cases (three cores per case from cancer and one core from matched normal intestinal mucosa) of primary small intestinal adenocarcinoma from 20 institutions of the Korean Small Intestinal Cancer Study Group were included. Moreover, 56 invasive breast carcinoma tissue sections from the Johns Hopkins Hospital and 29 neuroblastic tumor tissue sections from the University of Texas Southwestern Medical Center were also obtained. To validate and expand on the findings in this first set, a second set of multitumor arrays was obtained (set 2).18Baumhoer D. Tornillo L. Stadlmann S. Roncalli M. Diamantis E.K. Terracciano L.M. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.Am J Clin Pathol. 2008; 129: 899-906Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar TMAs in set 2 contained 2109 primary tumors from 61 cancer subtypes. In this set of tumors, each case was represented on the array by a single tissue core. In addition to the malignant tumors, 541 benign neoplasms (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org) and 264 normal tissue samples (see Supplemental Table S2 at http://ajp.amjpathol.org) were also obtained. The study was approved by the Johns Hopkins University School of Medicine institutional review board. Combined telomere-specific FISH and immunofluorescence labeling of PML protein was performed as described previously.13Meeker A.K. Gage W.R. Hicks J.L. Simon I. Coffman J.R. Platz E.A. March G.E. De Marzo A.M. Telomere length assessment in human archival tissues: combined telomere fluorescence in situ hybridization and immunostaining.Am J Pathol. 2002; 160: 1259-1268Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar, 14Montgomery E. Argani P. Hicks J.L. DeMarzo A.M. Meeker A.K. Telomere lengths of translocation-associated and nontranslocation-associated sarcomas differ dramatically.Am J Pathol. 2004; 164: 1523-1529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (75) Google Scholar Briefly, deparaffinized slides were hydrated, steamed for 25 minutes in citrate buffer (Vector Laboratories, Burlingame, CA), dehydrated, and hybridized with a Cy3-labeled peptide nucleic acid (PNA) probe complementary to the mammalian telomere repeat sequence [(N-terminus to C-terminus) 5′-CCCTAACCCTAACCCTAA-3′]. As a positive control for hybridization efficiency, an Invitrogen (Carlsbad, CA) Alexa Fluor 610-labeled PNA probe having specificity for human centromeric DNA repeats (5′-ATTCGTTGGAAACGGGA-3′, CENP-B binding sequence) was included in the hybridization solution.19Chen C. Hong Y.K. Ontiveros S.D. Egholm M. Strauss W.M. Single base discrimination of CENP-B repeats on mouse and human chromosomes with PNA-FISH.Mamm Genome. 1999; 10: 13-18Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar After posthybridization washes, an anti-PML antibody (1:100 dilution; catalog no. PG-M3; Dako, Carpinteria, CA) was incubated for 45 minutes at room temperature, followed by incubation of anti-mouse Alexa Fluor 488 fluorescent secondary antibody (catalog no. A-11001; Molecular Probes, Eugene, OR) and counterstaining with DAPI. Slides were imaged with a Nikon 50i epifluorescence microscope equipped with X-Cite series 120 illuminator (EXFO Photonics Solutions, Mississauga, ON, Canada) and appropriate fluorescence excitation/emission filters. Grayscale images were captured using Nikon NIS-Elements software version 2.30 and an attached Photometrics (Tucson, AZ) CoolSNAP EZ digital camera, pseudo-colored, and merged. All cases were assessed for the presence of the ALT phenotype. ALT-positive cases were identified by large, very bright intranuclear foci of telomere FISH signals marking ALT-associated telomeric foci throughout the tumor cells. Although telomere FISH signals from these individual bright foci often colocalized with PML protein, heterogeneity in this trait was observed, even within the same tumor. Given several instances in the literature of ALT-positive cell lines lacking telomere/PML colocalization,20Cerone M.A. Autexier C. Londoño-Vallejo J.A. Bacchetti S. A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT.Oncogene. 2005; 24: 7893-7901Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 21Fasching C.L. Bower K. Reddel R.R. Telomerase-independent telomere length maintenance in the absence of alternative lengthening of telomeres-associated promyelocytic leukemia bodies.Cancer Res. 2005; 65: 2722-2729Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 22Marciniak R.A. Cavazos D. Montellano R. Chen Q. Guarente L. Johnson F.B. A novel telomere structure in a human alternative lengthening of telomeres cell line.Cancer Res. 2005; 65: 2730-2737Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar colocalization was not considered an absolute requirement for classifying a case as ALT-positive. Thus, cases were classified as ALT-positive if they met the following criteria: first, the presence of ultra-bright intranuclear foci of telomere FISH signals (ALT-associated telomeric foci), with integrated total signal intensities for individual foci being >10-fold that of the per cell mean integrated signal intensities for all telomeric signals in individual benign stromal cells within the same case; second, ≥1% of tumor cells displaying these ALT-associated telomeric foci. Cases lacking ALT-associated telomeric foci in which at least 500 cells were assessed were considered ALT-negative. Areas exhibiting necrosis were excluded from consideration. When appropriate, different tumor subtypes were compared with a two-sided Fisher's exact test using SAS version 9.2 statistical packages (SAS Institute, Cary, NC). P values of <0.05 were considered to be significant. We identified the presence of the ALT phenotype by using telomere-specific FISH to visualize telomeric DNA in interphase nuclei of fixed tissue specimens. ALT-positive tumors are readily distinguishable by large ultra-bright telomere FISH signals, which are a nearly universal feature of ALT-positive cell populations.23Yeager T.R. Neumann A.A. Englezou A. Huschtscha L.I. Noble J.R. Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.Cancer Res. 1999; 59: 4175-4179PubMed Google Scholar In Figure 1, we present for comparison an ALT-negative invasive urothelial carcinoma case (Figure 1A) and an ALT-positive invasive urothelial carcinoma case (Figure 1B). The ALT-negative case displays robust telomere signals in the tumor cells and adjacent stromal cells; in the ALT-positive case, distinctive large, very bright intranuclear foci of telomere FISH signals mark ALT-associated telomeric foci throughout the tumor cells. Other representative ALT-positive cases shown include a renal sarcomatoid carcinoma (Figure 1C) and an anaplastic medulloblastoma (Figure 1D), neither of which has been previously identified as using the ALT pathway. In ALT-positive tumors, the percentage of cells containing ALT-associated telomeric foci varied by tumor type, ranging from 1% to >95% of tumor cells. This trait also varied among different tumors from the same cancer subtype. Finally, in Figure 1 we present two additional ALT-positive cases, an oligodendroglioma (Figure 1E) and an angiosarcoma (Figure 1F). In both of these cases, PML protein colocalizes to most of the ALT-associated telomere foci. The inset for each case highlights a typical APB, displaying a targetoid appearance of telomere DNA signal with a peripheral rim of PML protein. To determine the prevalence of the ALT phenotype in human cancers, we assessed two independent sets of malignant tissues comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes. Set 1 consisted of 4001 specimens encompassing a broad range of malignant tumors, including tumors arising from the adrenal gland, biliary tract, breast, central nervous system, colon, esophagus, gallbladder, kidney, liver, lung, ovary, pancreas, prostate, salivary gland, skin, small intestine, soft tissue, stomach, urinary bladder, and uterus (Table 1). A total of 141 tumors were identified as ALT-positive in set 1, yielding a prevalence of 3.52%. To confirm and expand on these findings, we further assessed the ALT phenotype in a second set of multitumor TMAs (set 2), which had previously been used to validate other molecular markers.18Baumhoer D. Tornillo L. Stadlmann S. Roncalli M. Diamantis E.K. Terracciano L.M. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.Am J Clin Pathol. 2008; 129: 899-906Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar This set of tumors consisted of 2109 primary tumor specimens from 61 different cancer subtypes. Set 2 included types similar to the first set, but also included hematopoietic and neuroendocrine neoplasms, as well as tumors arising from the oral cavity, pleura, tendon sheath, testis, and thyroid (Table 1). A total of 87 tumors were identified as ALT-positive in set 2, representing a prevalence of 4.13%. With cases from both sets combined, a total of 228 ALT-positive tumors were identified, representing an overall prevalence of the ALT phenotype in human cancers of 3.73% (Table 1).Table 1Prevalence of the ALT Phenotype in Human Cancer SubtypesLocation/Tumor typeALT+, set 1ALT+, set 2ALT+, overalln/N%n/N%n/N%Adrenal gland/peripheral nervous system Pheochromocytoma1/3931/2842/673 Neuroblastoma2/229—⁎Subtype not included in this set.—2/229 Ganglioneuroblastoma1/714——1/714Biliary Cholangiocarcinoma, extrahepatic0/230——0/230 Cholangiocarcinoma, intrahepatic0/100——0/100Breast Ductal carcinoma†Includes data from samples previously published.175/21720/3405/2512 Ductal carcinoma with lobular features0/200——0/200 Lobular carcinoma1/1470/1301/274 Mucinous carcinoma——0/1500/150 Tubular carcinoma——0/900/90 Medullary carcinoma0/101/5421/552Central nervous system Pilocytic astrocytoma (grade 1)2/5540/302/583 Diffuse astrocytoma (grade 2)14/19743/83817/2763 Anaplastic astrocytoma (grade 3)17/19892/111819/3063 Glioblastoma multiforme (grade 4; adult)9/65143/40812/10511 Glioblastoma multiforme (grade 4; pediatric)14/3244——14/3244 Oligodendroglioma6/20302/20108/4020 Medulloblastoma, anaplastic3/1718——3/1718 Medulloblastoma, nonanaplastic1/383——1/383 Other embryonal tumors1/1010——1/1010 Meningioma——1/4621/462 Schwannoma——1/4421/442Colon Adenocarcinoma0/7700/4900/1260Esophagus Adenocarcinoma0/9701/9111/1061 Squamous cell carcinoma——0/2900/290 Small cell carcinoma——0/100/10Gallbladder Adenocarcinoma1/2740/3301/602Hematopoietic neoplasms non-Hodgkin's lymphoma, other subtypes——0/5400/540 non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B-cell——0/1000/100 Hodgkin's lymphoma, nodular sclerosis——0/2300/230 Hodgkin's lymphoma, mixed cellularity——0/1700/170 Thymoma——0/3700/370Kidney Clear cell carcinoma1/6910/4801/1171 Papillary carcinoma0/5401/3231/861 Chromophobe carcinoma3/3781/10104/479 Sarcomatoid carcinoma2/277——2/277Larynx Squamous cell carcinoma——0/2900/290Liver Hepatocellular carcinoma7/9181/3038/1217Lung Adenocarcinoma0/6400/8900/1530 Squamous cell carcinoma0/5500/4500/1000 Papillary carcinoma0/450——0/450 Bronchioloalveolar carcinoma0/400——0/400 Small cell carcinoma0/1601/4721/632 Large cell carcinoma0/1001/2541/353 Carcinoma, other subtypes0/150——0/150 Carcinoid tumor0/30——0/30Neuroendocrine neoplasms Carcinoid tumor——2/3262/326 Paraganglioma——1/8131/813Oral cavity Squamous cell carcinoma——0/4100/410Ovary Serous carcinoma0/16300/4200/2050 Clear cell carcinoma2/564——2/564 Endometrioid carcinoma0/3201/4031/721 Mucinous carcinoma——0/2100/210Pancreas Adenocarcinoma0/42000/2800/4480Pleura Malignant mesothelioma——1/2841/284Prostate Adenocarcinoma0/107100/8100/11520 Small cell carcinoma0/240——0/240Salivary gland Carcinoma0/980——0/980Skin Malignant melanoma2/4745/5987/1067 Basal cell carcinoma——0/5700/570 Squamous cell carcinoma——0/5600/560Small intestine Adenocarcinoma0/19500/2000/2150Soft tissues Gastrointestinal stromal tumor0/340——0/340 Kaposi's sarcoma0/3300/2200/550 Ewing's sarcoma/primitive neuroectodermal tumor0/230——0/230 Undifferentiated pleomorphic sarcoma‡Includes cases classified as malignant fibrous histiocytoma.15/226818/306033/5263 Fibrosarcoma and variants3/2114——3/2114 Leiomyosarcoma11/138520/464331/5953 Liposarcoma3/10306/28219/3824 Angiosarcoma1/911——1/911 Epithelioid sarcoma2/633——2/633 Clear cell sarcoma0/50——0/50 Malignant peripheral nerve sheath tumor0/40——0/40 Rhabdomyosarcoma0/40——0/40 Chondrosarcoma2/2100——2/2100 Neurofibroma——4/37114/3711Stomach Adenocarcinoma0/8000/7500/1550Tendon sheath Giant cell tumor——0/2200/220Testis Seminoma——0/4800/480 Nonseminomatous germ cell tumor——7/46157/4615Thyroid Follicular carcinoma——0/5200/520 Papillary carcinoma——0/3000/300Urinary bladder Invasive urothelial carcinoma2/7530/7502/1501 Non-invasive urothelial carcinoma——0/3800/380 Small cell carcinoma3/1323——3/1323 Non-invasive papillary urothelial carcinoma0/50——0/50 Squamous carcinoma0/20——0/20 Sarcomatoid carcinoma0/10——0/10Uterus Cervix, squamous carcinoma3/12720/2503/1522 Cervix, adenocarcinoma0/190——0/190 Endometrium, endometrioid carcinoma0/1600/4800/640 Endometrium, serous carcinoma1/9112/3263/417 Endometrium, mixed mesodermal tumor0/40——0/40 Endometrium, clear cell carcinoma0/30——0/30 Subtype not included in this set.† Includes data from samples previously published.17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar‡ Includes cases classified as malignant fibrous histiocytoma. Open table in a new tab Although we recently described the presence of the ALT phenotype in a small subset of breast carcinomas,17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar the ALT phenotype has rarely been reported in other epithelial malignancies.16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar Here, we report the presence of the ALT phenotype in numerous epithelial malignancies. The ALT phenotype was present in 8/121 (7%) cases of hepatocellular carcinoma, 3/41 (7%) cases of serous endometrial carcinoma, 3/152 (2%) cases of squamous cervical carcinoma, 1/60 (2%) case of gallbladder adenocarcinoma, and 1/106 (1%) case of esophageal adenocarcinoma. In renal carcinoma, the ALT phenotype was observed in 4/47 (9%) cases of chromophobe carcinoma, 2/27 (7%) cases of sarcomatoid carcinoma, 1/117 (1%) case of clear cell carcinoma, and 1/86 (1%) case of papillary carcinoma. In urinary bladder carcinomas, we observed the presence of ALT in 3/13 (7%) cases of small cell bladder carcinoma and 2/150 (1%) cases of invasive urothelial carcinoma. Although ALT was not observed in most lung carcinoma subtypes, we did observe a single case each of large cell [1/35 (3%)] and small cell [1/63 (2%)] carcinomas that exhibited the ALT phenotype. In addition to the novel findings in epithelial malignancies, we present here the first report of ALT in several tumor types of nonepithelial origin, including medulloblastomas, pediatric GBMs, oligodendrogliomas, meningiomas, and schwannomas. In medulloblastomas, the prevalence of ALT-positive tumors varied across subtypes: 18% in anaplastic medulloblastomas and 3% in nonanaplastic medulloblastomas. The prevalence of the ALT phenotype in adult GBM cases was 11%. We also assessed 32 cases of pediatric GBM and observed a statistically significant increase in the prevalence of the ALT phenotype in the pediatric cases (44%), compared with the adult cases (P = 0.0002). In other central nervous system tumors, the prevalence of ALT was 20% in oligodendrogliomas, 2% in meningiomas, and 2% in schwannomas. There appear to be several cancer subtypes that rarely, if ever, use the ALT telomere maintenance mechanism. In particular, we did not observe the ALT phenotype in adenocarcinomas arising from the prostate (N = 1152), pancreas (N = 448), small intestine (N = 215), stomach (N = 155), or colon (N = 126). Although the numbers of cases were smaller, we also did not observe the ALT phenotype in cholangiocarcinomas, laryngeal squamous cell carcinomas, oral squamous cell carcinomas, salivary gland carcinomas, follicular and papillary thyroid carcinomas, giant cell tumors of the tendon sheath, or hematopoietic neoplasms. Although malignancies arising from certain organs (eg, prostate cancer) rarely, if ever, develop ALT, there are malignancies from other organ sites that are capable of developing the ALT phenotype, but apparently only in particular cancer subtypes. Notably, in lung carcinoma, the ALT phenotype was observed only in a small subset of carcinomas originating from neuroendocrine cells; it was not observed in any other subtype. Other specific subtypes in which we did not observe the ALT phenotype include ovarian serous carcinoma, endometrioid carcinoma of the endometrium, seminoma, and basal cell and squamous cell carcinoma of the skin. Although the ALT phenotype is highly prevalent in certain types of sarcomas, we did not find evidence of the ALT phenotype in gastrointestinal stromal tumors, Kaposi's sarcomas, or Ewing's sarcomas/primitive neuroectodermal tumors. Next, we assessed a set of 264 normal tissues encompassing a wide range of tissue types. The ALT phenotype was not observed in these non-neoplastic tissue samples (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org). In accord with this observation, we did not observe the ALT phenotype in non-neoplastic tissue entrapped in or adjacent to any of the tumors assessed. We also assessed a set of 541 benign neoplasms arising from a range of different tissues. The ALT phenotype was not observed in these benign neoplasms (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org). Although we did not specifically assess intraepithelial neoplasms, we did observe the ALT phenotype in two individual cases: a melanoma in situ and a case of cervical intraepithelial neoplasia (grade 3). For representative images demonstrating the presence of ALT-associated telomeric foci in these cases (see Supplemental Figure S1 at http://ajp.amjpathol.org). In the present study, we comprehensively surveyed the A

Ovarian clear cell carcinoma (CCC) is one of the most malignant types of ovarian carcinomas, particularly at advanced stages. Unlike the more common type of ovarian cancer, high-grade serous carcinoma, ovarian CCC is often resistant to platinum-based chemotherapy, and therefore an effective treatment for this tumor type at advanced stages is urgently needed. In this study, we analyzed 97 ovarian CCCs for sequence mutations in KRAS, BRAF, PIK3CA, TP53, PTEN, and CTNNB1 as these mutations frequently occur in other major types of ovarian carcinomas. The samples included 18 CCCs for which affinity-purified tumor cells from fresh specimens were available, 69 microdissected tumors from paraffin tissues, and 10 tumor cell lines. Sequence mutations of PIK3CA, TP53, KRAS, PTEN, CTNNB1, and BRAF occurred in 33%, 15%, 7%, 5%, 3%, and 1% of CCC cases, respectively. Sequence analysis of PIK3CA in 28 affinity-purified CCCs and CCC cell lines showed a mutation frequency of 46%. Samples with PIK3CA mutations showed intense phosphorylated AKT immunoreactivity. These findings demonstrate that ovarian CCCs have a high frequency of activating PIK3CA mutations. We therefore suggest that the use of PIK3CA-targeting drugs may offer a more effective therapeutic approach compared with current chemotherapeutic agents for patients with advanced-stage and recurrent CCC. Ovarian clear cell carcinoma (CCC) is one of the most malignant types of ovarian carcinomas, particularly at advanced stages. Unlike the more common type of ovarian cancer, high-grade serous carcinoma, ovarian CCC is often resistant to platinum-based chemotherapy, and therefore an effective treatment for this tumor type at advanced stages is urgently needed. In this study, we analyzed 97 ovarian CCCs for sequence mutations in KRAS, BRAF, PIK3CA, TP53, PTEN, and CTNNB1 as these mutations frequently occur in other major types of ovarian carcinomas. The samples included 18 CCCs for which affinity-purified tumor cells from fresh specimens were available, 69 microdissected tumors from paraffin tissues, and 10 tumor cell lines. Sequence mutations of PIK3CA, TP53, KRAS, PTEN, CTNNB1, and BRAF occurred in 33%, 15%, 7%, 5%, 3%, and 1% of CCC cases, respectively. Sequence analysis of PIK3CA in 28 affinity-purified CCCs and CCC cell lines showed a mutation frequency of 46%. Samples with PIK3CA mutations showed intense phosphorylated AKT immunoreactivity. These findings demonstrate that ovarian CCCs have a high frequency of activating PIK3CA mutations. We therefore suggest that the use of PIK3CA-targeting drugs may offer a more effective therapeutic approach compared with current chemotherapeutic agents for patients with advanced-stage and recurrent CCC. Ovarian carcinomas are a heterogeneous group of neoplasms that can be classified according to the type and degree of differentiation. Despite the fact that clinical management of ovarian cancer at the present time largely fails to take this heterogeneity into account, it has becoming clear that each major histological type has unique molecular genetic defects that deregulate specific signaling pathways in the cancer cells.1Cho KR Shih IM Ovarian cancer.Annu Rev Pathol Mech Dis. 2009; 4: 287-313Crossref PubMed Scopus (552) Google Scholar Ovarian clear cell carcinoma (CCC) is one of the most lethal types of ovarian cancer, with a 5-year survival rate (all stages) of less than 35%.2Takano M Kikuchi Y Yaegashi N Kuzuya K Ueki M Tsuda H Suzuki M Kigawa J Takeuchi S Tsuda H Moriya T Sugiyama T Clear cell carcinoma of the ovary: a retrospective multicentre experience of 254 patients with complete surgical staging.Br J Cancer. 2006; 94: 1369-1374Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar Unlike the more common type of ovarian carcinoma, high-grade serous carcinoma, CCC is often resistant to platinum-based chemotherapy.3Chan JK Teoh D Hu JM Shin JY Osann K Kapp DS Do clear cell ovarian carcinomas have poorer prognosis compared to other epithelial cell types? A study of 1411 clear cell ovarian cancers.Gynecol Oncol. 2008; 109: 370-376Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 4Pectasides D Fountzilas G Aravantinos G Kalofonos C Efstathiou H Farmakis D Skarlos D Pavlidis N Economopoulos T Dimopoulos MA Advanced stage clear-cell epithelial ovarian cancer: the Hellenic Cooperative Oncology Group experience.Gynecol Oncol. 2006; 102: 285-291Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar, 5Goff BA Sainz de la Cuesta R Muntz HG Fleischhacker D Ek M Rice LW Nikrui N Tamimi HK Cain JM Greer BE Fuller Jr, AF Clear cell carcinoma of the ovary: a distinct histologic type with poor prognosis and resistance to platinum-based chemotherapy in stage III disease.Gynecol Oncol. 1996; 60: 412-417Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (310) Google Scholar, 6Sugiyama T Kamura T Kigawa J Terakawa N Kikuchi Y Kita T Suzuki M Sato I Taguchi K Clinical characteristics of clear cell carcinoma of the ovary: a distinct histologic type with poor prognosis and resistance to platinum-based chemotherapy.Cancer. 2000; 88: 2584-2589Crossref PubMed Scopus (679) Google Scholar, 7Crotzer DR Sun CC Coleman RL Wolf JK Levenback CF Gershenson DM Lack of effective systemic therapy for recurrent clear cell carcinoma of the ovary.Gynecol Oncol. 2007; 105: 404-408Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (126) Google Scholar, 8Takano M Sugiyama T Yaegashi N Sakuma M Suzuki M Saga Y Kuzuya K Kigawa J Shimada M Tsuda H Moriya T Yoshizaki A Kita T Kikuchi Y Low response rate of second-line chemotherapy for recurrent or refractory clear cell carcinoma of the ovary: a retrospective Japan Clear Cell Carcinoma Study.Int J Gynecol Cancer. 2008; 18: 937-942Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar Several studies have attempted to elucidate the molecular pathogenesis of ovarian CCC with the goal of identifying molecular targets that are altered in this tumor type,1Cho KR Shih IM Ovarian cancer.Annu Rev Pathol Mech Dis. 2009; 4: 287-313Crossref PubMed Scopus (552) Google Scholar but these reports have been of limited value because of insufficient sample size. In this study, we analyzed 97 ovarian CCCs for sequence alterations in genes that participate in several major cancer-associated pathways including TP53, KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN, and CTNNB1. We demonstrated frequent PIK3CA mutations in CCCs, especially those from purified tumors and cell lines. Our findings suggest that PIK3CA-targeting drugs may be a more effective therapy than current chemotherapeutic agents for patients with advanced stage and recurrent disease. The tumors included 10 cases from the Johns Hopkins Hospital, 52 cases from National Taiwan University Hospital, and 25 cases from the Seirei Mikatahara Hospital, Japan. H&E-stained sections from tissue specimens were reviewed and the diagnosis of ovarian CCCs confirmed by an expert gynecologic pathologist (RJK). All of the specimens were anonymous and tissues collected in compliance with institutional review board regulations. In addition, we also analyzed 10 established ovarian CCC cell lines. As the sensitivity of mutation detection in primary tumors is dramatically affected by the purity of the tumor DNA samples analyzed, we affinity purified tumor cells using Epi-CAM antibody magnetic beads from all 18 freshly collected samples.9Nakayama K Nakayama N Kurman RJ Cope L Pohl G Samuels Y Velculescu VE Wang TL Shih Ie M Sequence mutations and amplification of PIK3CA and AKT2 genes in purified ovarian serous neoplasms.Cancer Biol Ther. 2006; 5: 779-785Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar We also microdissected tumor cells from 69 paraffin-embedded tumors. The relevant exons of the genes indicated in Table 1 in each tumor sample were PCR-amplified, sequenced, and assessed for potential sequence alterations using approaches previously described.9Nakayama K Nakayama N Kurman RJ Cope L Pohl G Samuels Y Velculescu VE Wang TL Shih Ie M Sequence mutations and amplification of PIK3CA and AKT2 genes in purified ovarian serous neoplasms.Cancer Biol Ther. 2006; 5: 779-785Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar, 10Salani R Kurman RJ Giuntoli 2nd, R Gardner G Bristow R Wang TL Shih IM Assessment of TP53 mutation using purified tissue samples of ovarian serous carcinomas reveals a higher mutation rate than previously reported and does not correlate with drug resistance.Int J Gynecol Cancer. 2008; 18: 487-491Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar The nucleotide sequences were then analyzed using the Mutation Surveyor program (Soft Genetics LLC, State College, PA) and the sequencing data were analyzed by two investigators independently.Table 1PCR and Sequencing PrimersGeneExonPrimer 1 sequencePrimer 2 sequenceKRAS15′-GTAAAACGACGGCCAGTTTGAAACCCAAGGTACATTTCAG-3′5′-TCTTAAGCGTCGATGGAGGAG-3′KRAS25′-GTAAAACGACGGCCAGTATGCATGGCATTAGCAAAGAC-3′5′-CGTCATCTTTGGAGCAGGAAC-3′BRAF155′-GTAAAACGACGGCCAGTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAA-3′5′-TCATCCTAACACATTTCAAGCC-3′TP5335′-GTAAAACGACGGCCAGTGAGGAATCCCAAAGTTCCAAAC-3′5′-ACGTTCTGGTAAGGACAAGGG-3′TP5345′-GTAAAACGACGGCCAGTGGGCCAGACCTAAGAGCAATC-3′5′-AAGCTCCTGAGGTGTAGACGC-3′TP5355′-AGGCCCTTAGCCTCTGTAAGC-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTCTGCTCAGATAGCGATGGTG-3′TP5365′-GTAAAACGACGGCCAGTAGAAATCGGTAAGAGGTGGGC-3′5′-CATCCTGGCTAACGGTGAAAC-3′TP5375′-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGCAGTGCTAGGAAAGAG-3′5′-GTTGGGAGTAGATGGAGCCTG-3′PIK3CA15′-TGCTTTGGGACAACCATACATC-3′5′-CTTGCTTCTTTAAATAGTTCATGCTTT-3′PIK3CA15′-CCCCTCCATCAACTTCTTCAA-3′5′-ATTGTATCATACCAATTTCTCGATTG-3′PIK3CA95′-TCAGCAGTTACTATTCTGTGACTGG-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTGCTGAGATCAGCCAAATTCA-3′PIK3CA205′-GTAAAACGACGGCCAGTGACATTTGAGCAAAGACCTGAAG-3′5′-TGGATTGTGCAATTCCTATGC-3′PTEN15′-TTTCCATCCTGCAGAAGAAGC-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTCCGTCTAGCCAAACACACC-3′PTEN25′-GTAAAACGACGGCCAGTTCTGTGATGTATAAACCGTGAGTTTC-3′5-′CCCTGAAGTCCATTAGGTACGG-3′PTEN35′-GTAAAACGACGGCCAGTCATGATTACTACTCTAAACCCATAGAAGG-3′5′-TCAAATATGGGCTAGATGCCA-3′PTEN45′-ATAAAGATTCAGGCAATGTTTGTTAG-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTGACCAACTGCCTCAAATAGTAGG-3′PTEN55′-TGCAACATTTCTAAAGTTACCTACTTG-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTTTACTTGTCAATTACACCTCAATAAA-3′PTEN65′-AATGGCTACGACCCAGTTACC-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTTTGGCTTCTTTAGCCCAATG-3′PTEN75′-GTAAAACGACGGCCAGTTGCAGATACAGAATCCATATTTCG-3′5′-AATGTCTCACCAATGCCAGAG-3′PTEN85′-TGCAACAGATAACTCAGATTGCC-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTGTCAAGCAAGTTCTTCATCAGC-3′PTEN95′-GTAAAACGACGGCCAGTAAAGATCATGTTTGTTACAGTGCTTAAA-3′5′-TGACACAATGTCCTATTGCCA-3′CTNNB125′-AAATATTTCAATGGGTCATATCACAG-3′5′-GTAAAACGACGGCCAGTTCCACAGTTCAGCATTTACCTAAG-3′ Open table in a new tab We assessed AKT phosphorylation in 58 CCCs including 18 cases with PIK3CA mutations and 40 cases without the mutations using an anti-pAkt (Ser473) monoclonal antibody (Cell Signaling). Immunohistochemistry was performed on deparaffinized sections using the antibody at a dilution of 1:50 and an EnVision+System peroxidase kit (DAKO, Carpinteria, CA). Immunoreactivity was scored by two investigators as follows: 0: undetectable, 1+: weakly positive, 2+: moderately positive and 3+: intensely positive. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) were genotyped using the 250K StyI arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA) in the Microarray Core Facility at the Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA. The dChip 2006 program was used to analyze SNP array data.11Slamon DJ GW Jones LA Holt JA Wong SG Keith DE Levin WJ Stuart SG Udove J Ullrich A Press MF Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.Science. 1989; 244: 707-712Crossref PubMed Scopus (6281) Google Scholar, 12Cheng JQ Godwin AK Bellacosa A Taguchi T Franke TF Hamilton TC Tsichlis PN Testa JR AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 9267-9271Crossref PubMed Scopus (650) Google Scholar Data were normalized to a baseline array with median signal intensity at the probe intensity level using the invariant set normalization method. Signal values for each SNP were compared with the average intensities from 15 normal samples. To infer the DNA copy number from the raw signal data, we used the Hidden Markov Model,11Slamon DJ GW Jones LA Holt JA Wong SG Keith DE Levin WJ Stuart SG Udove J Ullrich A Press MF Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.Science. 1989; 244: 707-712Crossref PubMed Scopus (6281) Google Scholar based on the assumption of diploid for normal samples. Mapping information of SNP locations and cytogenetic bands were based on curation of Affymetrix and University of California Santa Cruz hg17. In this study, we used an arbitrary cutoff of more than three copies in more than six consecutive SNPs, to define an amplification. DNA copy number of the PIK3CA locus in 10 CCC cell lines was assessed by quantitative real-time PCR using an iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) with SYBR green dye (Molecular Probes, Eugene, OR). The primer sequences that amplified the first exon are: 5′-CCCCTCCATCAACTTCTTCAA-3′ (forward) and 5′-ATTGTATCATACCAATTTCTCGATTG-3′ (reverse). Averages in the threshold cycle number of triplicate measurements were obtained. The results were expressed as the difference between the threshold cycle of the gene of interest and the threshold cycle of a Line-1 gene for which expression is relatively constant among tumor tissues. The mutation profile of all of the specimens is summarized in Table 2 and the detailed mutations in each sample were listed in supplementary Table 1 (at http://ajp.amjpathol.org). Sequence mutations (at the mutation hot spots) of PIK3CA, TP53, KRAS, PTEN, CTNNB1, and BRAF, were detected in 33%, 15%, 7%, 5%, 3%, and 1%, of informative CCC cases, respectively. Among the genes analyzed, PIK3CA was the most frequently mutated and was therefore selected for further characterization. We found that the percentage of PIK3CA mutations was even higher (46%) in the 28 cases of affinity purified CCCs and CCC cell lines. Most of the PIK3CA mutations were mapped to exon 9 and exon 20 resulting in kinase activation of p110α which has been shown to result in increased cellular survival and invasion. Because AKT activation by phosphorylation can occur as a result of constitutive activating mutations in PIK3CA, we assessed AKT phosphorylation in 58 tumors, including 18 cases with PIK3CA mutations and 40 cases without mutations. We found that all 18 specimens with PIK3CA mutations and 34 (85%) of 40 cases with wild-type PIK3CA showed intense and diffuse phosphorylated AKT immunoreactivity. There was no statistical difference of phosphorylated AKT immunoreactivity (extent and intensity) between these two groups (P = 0.16). These results indicate that PIK3CA mutations directly activate AKT in CCCs, and other mechanisms rather than sequence mutations are involved in activating the pathway for those CCCs with wild-type PIK3CA.Table 2Sequence Mutation Rates in Ovarian Clear Cell CarcinomasSample (n)KRASBRAFTP53PIK3CACTNNB1PTENJH (10)20%0%10%50%0%0%TW (8)0%0%ND50%0%0%Cell line (10)10%10%20%40%0%10%TW-paraffin (44)9%0%ND25%2%NDJP-paraffin (25)0%0%ND32%8%NDOverall: non-paraffin (JH + TW + Cell line)11%3%15%46%0%5%Overall (97)7%1%15%33%1%5%JH: freshly purified tumor cells from tumor tissues at the Johns Hopkins Hospital.TW: freshly purified tumor cells from tumor tissues at the National Taiwan University Hospital.TW-paraffin: paraffin-embedded tumors from National Taiwan University Hospital.JP-paraffin: paraffin-embedded tumors from the Seirei Mikatahara Hospital, Japan.ND: not determined. Open table in a new tab JH: freshly purified tumor cells from tumor tissues at the Johns Hopkins Hospital. TW: freshly purified tumor cells from tumor tissues at the National Taiwan University Hospital. TW-paraffin: paraffin-embedded tumors from National Taiwan University Hospital. JP-paraffin: paraffin-embedded tumors from the Seirei Mikatahara Hospital, Japan. ND: not determined. In an effort to determine whether the PIK3CA locus was genomically amplified, we applied a genome-wide analysis for DNA copy number alterations in the 12 affinity-purified ovarian CCCs using 250K SNP arrays and performed quantitative real-time PCR to determine the DNA copy number in the PIK3CA locus in 10 cell lines. We did not observe any DNA copy number change in any of the tumors and cell lines (see Supplemental Figure S1 at http://ajp.amjpathol.org). Thus, it is likely that PIK3CA mutation is the main molecular genetic change that constitutively activates the PI3K/AKT pathway in ovarian CCC. Finally, to determine the clinical significance of PIK3CA mutation in ovarian CCCs, we correlated its mutation status with various clinicopathologic parameters. There was no significant correlation between the PIK3CA mutation status and histological features, clinical stage, patient age, disease-free interval, and overall survival (P > 0.05 for all clinical parameters examined). The findings from this study have important biological and clinical ramifications for ovarian cancer. First, although previous reports have detected PIK3CA mutations in ovarian CCC, those studies analyzed a small number of cases and therefore the investigators could not draw firm conclusions about the frequency of PIK3CA mutations and the generalizability of their findings.13Wang Y Helland A Holm R Kristensen GB Borresen-Dale AL PIK3CA mutations in advanced ovarian carcinomas.Hum Mutat. 2005; 25: 322Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 14Willner J Wurz K Allison KH Galic V Garcia RL Goff BA Swisher EM Alternate molecular genetic pathways in ovarian carcinomas of common histological types.Hum Pathol. 2007; 38: 607-613Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar, 15Campbell IG Russell SE Choong DY Montgomery KG Ciavarella ML Hooi CS Cristiano BE Pearson RB Phillips WA Mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer.Cancer Res. 2004; 64: 7678-7681Crossref PubMed Scopus (792) Google Scholar In the present study, we analyzed a total of 97 ovarian CCCs and demonstrated that more than a third had PIK3CA mutations. This observation is important because of the well-established role of PI3K in oncogenesis in several types of human cancer.16Samuels Y Diaz Jr, LA Schmidt-Kittler O Cummins JM Delong L Cheong I Rago C Huso DL Lengauer C Kinzler KW Vogelstein B Velculescu VE Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells.Cancer Cell. 2005; 7: 561-573Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (744) Google Scholar, 17Samuels Y Velculescu VE Oncogenic mutations of PIK3CA in human cancers.Cell Cycle. 2004; 3: 1221-1224Crossref PubMed Scopus (391) Google Scholar, 18Samuels Y Wang Z Bardelli A Silliman N Ptak J Szabo S Yan H Gazdar A Powell SM Riggins GJ Willson JK Markowitz S Kinzler KW Vogelstein B Velculescu VE High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers.Science. 2004; 304: 554Crossref PubMed Scopus (2941) Google Scholar, 19Guerreiro AS Fattet S Fischer B Shalaby T Jackson SP Schoenwaelder SM Grotzer MA Delattre O Arcaro A Targeting the PI3K p110a isoform inhibits medulloblastoma proliferation, chemoresistance, and migration.Clin Cancer Res. 2008; 14: 6761-6769Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar It is particularly interesting that among all of the cancer types reported so far, ovarian CCC has the highest frequency of PIK3CA mutations. Of note, in the current study we only sequenced those exons with the most common mutations in the selected genes and therefore the actual mutation frequency could be higher than the one reported here. Our results also provide additional support to the view that ovarian cancer is a heterogeneous group of neoplastic diseases, which are characterized by their signature molecular genetic aberrations.20Shih I-M Kurman RJ Ovarian tumorigenesis-a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis.Am J Pathol. 2004; 164: 1511-1518Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1031) Google Scholar Specifically, high-grade serous carcinoma is characterized by frequent mutations of TP53 and high levels of chromosomal instability.20Shih I-M Kurman RJ Ovarian tumorigenesis-a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis.Am J Pathol. 2004; 164: 1511-1518Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1031) Google Scholar, 21Kuo KT, Guan B, Feng Y, Mao TL, Chen X, Jinawath N, Wang Y, Kurman RJ, Shih IM, Wang TL: Analysis of DNA copy number alterations in ovarian serous tumors identifies new molecular genetic changes in low-grade and high-grade carcinomas. Cancer Res (in press)Google Scholar In contrast, low-grade serous carcinoma frequently harbors mutations in KRAS/BRAF/ERBB2, endometrioid carcinoma has PTEN and CTNNB1 mutations in most of cases, and mucinous carcinoma has KRAS mutations in more than half of the cases1Cho KR Shih IM Ovarian cancer.Annu Rev Pathol Mech Dis. 2009; 4: 287-313Crossref PubMed Scopus (552) Google Scholar, 20Shih I-M Kurman RJ Ovarian tumorigenesis-a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis.Am J Pathol. 2004; 164: 1511-1518Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1031) Google Scholar(Figure 1). The high frequency of PIK3CA mutation and the low rate of mutations in KRAS, BRAF, TP53, PTEN, and CTNNB1 indicate that CCCs have a different molecular signature from other surface epithelial tumors. Both ovarian endometrioid carcinoma and CCC are thought to develop from endometriosis,22Tan DS Kaye S Ovarian clear cell adenocarcinoma: a continuing enigma.J Clin Pathol. 2007; 60: 355-360Crossref PubMed Scopus (99) Google Scholar but endometrioid carcinoma has a high frequency of PTEN and CTNNB1 mutations while CCC has a low frequency of mutations in these genes. Thus, our data provide evidence that the underlying genetic events in CCC and endometrioid carcinoma are inherently different despite the fact that the precursor lesion, endometriosis, is the same for both tumors. From a therapeutic perspective, our results underscore the importance of carefully separating these different types of ovarian tumors in clinical trials evaluating different types of treatments. The relatively high frequency of PIK3CA mutations holds promise for new therapeutic approaches using small molecule inhibitors targeting PI3K. New PI3K targeting drugs, including GDC-0941,23Folkes AJ Ahmadi K Alderton WK Alix S Baker SJ Box G Chuckowree IS Clarke PA Depledge P Eccles SA Friedman LS Hayes A Hancox TC Kugendradas A Lensun L Moore P Olivero AG Pang J Patel S Pergl-Wilson GH Raynaud FI Robson A Saghir N Salphati L Sohal S Ultsch MH Valenti M Wallweber HJ Wan NC Wiesmann C Workman P Zhyvoloup A Zvelebil MJ Shuttleworth SJ The identification of 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-1-ylmethyl)-4-morpholin -4-yl-thieno[3,2-d]pyrimidine (GDC-0941) as a potent, selective, orally bioavailable inhibitor of class I PI3 kinase for the treatment of cancer.J Med Chem. 2008; 51: 5522-5532Crossref PubMed Scopus (663) Google Scholar NVP-BEZ235,24Schnell CR Stauffer F Allegrini PR O'Reilly T McSheehy PM Dartois C Stumm M Cozens R Littlewood-Evans A Garcia-Echeverria C Maira SM Effects of the dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor NVP-BEZ235 on the tumor vasculature: implications for clinical imaging.Cancer Res. 2008; 68: 6598-6607Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar, 25Maira SM Stauffer F Brueggen J Furet P Schnell C Fritsch C Brachmann S Chene P De Pover A Schoemaker K Fabbro D Gabriel D Simonen M Murphy L Finan P Sellers W Garcia-Echeverria C Identification and characterization of NVP-BEZ235, a new orally available dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity.Mol Cancer Ther. 2008; 7: 1851-1863Crossref PubMed Scopus (1022) Google Scholar PI-103,26Prevo R Deutsch E Sampson O Diplexcito J Cengel K Harper J O'Neill P McKenna WG Patel S Bernhard EJ Class I PI3 kinase inhibition by the pyridinylfuranopyrimidine inhibitor PI-103 enhances tumor radiosensitivity.Cancer Res. 2008; 68: 5915-5923Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar and SF1126, a LY294002 prodrug,27Garlich JR De P Dey N Su JD Peng X Miller A Murali R Lu Y Mills GB Kundra V Shu HK Peng Q Durden DL A vascular targeted pan phosphoinositide 3-kinase inhibitor prodrug. SF1126, with antitumor and antiangiogenic activity.Cancer Res. 2008; 68: 206-215Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar have recently been developed and are being evaluated in clinical trials.23Folkes AJ Ahmadi K Alderton WK Alix S Baker SJ Box G Chuckowree IS Clarke PA Depledge P Eccles SA Friedman LS Hayes A Hancox TC Kugendradas A Lensun L Moore P Olivero AG Pang J Patel S Pergl-Wilson GH Raynaud FI Robson A Saghir N Salphati L Sohal S Ultsch MH Valenti M Wallweber HJ Wan NC Wiesmann C Workman P Zhyvoloup A Zvelebil MJ Shuttleworth SJ The identification of 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-1-ylmethyl)-4-morpholin -4-yl-thieno[3,2-d]pyrimidine (GDC-0941) as a potent, selective, orally bioavailable inhibitor of class I PI3 kinase for the treatment of cancer.J Med Chem. 2008; 51: 5522-5532Crossref PubMed Scopus (663) Google Scholar, 25Maira SM Stauffer F Brueggen J Furet P Schnell C Fritsch C Brachmann S Chene P De Pover A Schoemaker K Fabbro D Gabriel D Simonen M Murphy L Finan P Sellers W Garcia-Echeverria C Identification and characterization of NVP-BEZ235, a new orally available dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity.Mol Cancer Ther. 2008; 7: 1851-1863Crossref PubMed Scopus (1022) Google Scholar, 28Marone R Cmiljanovic V Giese B Wymann MP Targeting phosphoinositide 3-kinase: moving towards therapy.Biochim Biophys Acta. 2008; 1784: 159-185Crossref PubMed Scopus (509) Google Scholar In the future, it will be important to design clinical trials to evaluate the efficacy of such inhibitors by correlating clinical response with PIK3CA mutational status or pathway activation. If such studies show promising results, this would be an important step in the development of customized treatment for ovarian CCC at advanced stages. Download .ppt (.05 MB) Help with ppt files Supplementary Table 1 Download .ppt (.55 MB) Help with ppt files Supplementary Material